[發明專利]一種用于培育抗氧化微生物的基因

有效

• 申請號: 201610140426.6
• 申請日: 2016-03-11
• 公開（公告）號: CN107177605B
• 公開（公告）日: 2020-12-04
• 發明（設計）人: 王勁;林敏;平淑珍;左開井;江世杰
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C07K14/195;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 張濤

本發明發現了一種用于培育抗氧化微生物的基因。本發明構建了含該基因的重組質粒，將其導入原核宿主細胞大腸桿菌表達菌株BL21中。實驗證明，本發明發現的基因在原核生物中表達后，能夠提高細胞的抗氧化能力。

技術領域

本發明涉及一種用于培育抗氧化微生物的基因。

背景技術

耐輻射異常球菌(Deinococcus radiodurans R1,DR)具有對電離輻射、UV輻射、DNA損傷試劑等抗性，是研究微生物非生物脅迫適應機制的理想菌株。曾有人對耐輻射異常球菌中大量功能未知基因(如IrrE、Csp等蛋白)進行研究，比如，將D.radiodurans R1中4個與植物抗旱相關的基因在原核宿主細胞和植物中表達后，能夠增強宿主的耐鹽抗性等。

然而，對本研究發現的來源于D.radiodurans R1新基因dwh，并未見其在提高細胞抗氧化能力方面的研究報道。

發明內容

本發明的目的是從D.radiodurans R1中發現一種用于培育抗氧化微生物的新基因。

本發明通過如下研究發現：

1、耐輻射異常球菌R1中含有編碼Why(Water stress and Hypersensitiveresponse)類似蛋白的基因，命名為dwh，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該基因編碼的蛋白(Dwh蛋白)具有抗氧化的功能，可用于培育抗氧化微生物，進而為培育具有抗氧化性狀的植物提供參考依據，其蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、利用http://web.expasy.org/protparam/對Dwh蛋白氨基酸序列進行在線預測，該蛋白由99個氨基酸組成，分子式C₄₆₆H₇₇₂N₁₃₄O₁₃₈，其分子量為10.46kDa，理論等電點為9.94，不穩定指數29.04，屬于穩定蛋白質；對Dwh蛋白氨基酸序列分析發現，該蛋白富含Leu(15.15％)、Val(12.12％)、Ala(10.1％)、Thr(10.1％)，帶負電氨基酸殘基總數(Asp+Glu)為7，帶正電氨基酸殘基總數(Arg+Lys)為9，其中疏水氨基酸殘基含量為50.5％，總平均疏水指數(GRAVY)為0.165，同時，采用KyteDoolittle方法對Dwh蛋白進行疏水性分析也顯示出其高度的疏水特性(圖1)。因此，推測該蛋白是一類典型的疏水蛋白。此外，二級結構預測顯示(圖2)，Dwh蛋白由6個β折疊和靠近C端的1個α螺旋組成。

3、獲得D.radiodurans R1dwh基因的缺失突變株Δdwh

通過PCR獲得dwh基因上下游基因片段(dwh-U和dwh-D)，同時獲得編碼卡那霉素抗性蛋白的Km基因片段(K)(圖3)，采用融合PCR技術將dwh-U、K、dwh-D三片段融合，獲得dwh-UKD重組片段。然后將重組片段通過同源重組技術轉化D.radiodurans R1感受態細胞，在含有Km抗性的TGY平板上進行壓力篩選，獲得dwh基因的缺失突變株Δdwh，并進行PCR及測序驗證(圖4)(見實施例1)。

4、D.radiodurans R1 dwh基因缺失突變株Δdwh的抗氧化實驗

1)對野生型DR及突變株Δdwh分別進行氧化脅迫處理(80mM H₂O₂處理30min)，觀察不同菌株在氧化脅迫條件下的存活能力。結果顯示，氧化脅迫條件下試驗菌株存活能力均有下降，缺失dwh基因的突變株Δdwh與野生型DR菌株相比更加敏感，菌株存活能力下降1個數量級(見實施例2和圖5、6)。結果表明dwh基因編碼的蛋白對D.radiodurans R1耐受氧化脅迫具有重要貢獻。