[發明專利]高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及應用

有效

• 申請號: 201610134833.6
• 申請日: 2016-03-09
• 公開（公告）號: CN107177517B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 朱泰承;孫紅兵;李寅
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/36;C12N9/38;C12R1/84
• 代理公司: 北京律和信知識產權代理事務所(普通合伙) 11446
• 代理人: 鮑曉芳;武玉琴

本發明提供一種高效耐受和利用甲醇的酵母菌株，該菌株是傳統畢赤酵母菌株經連續傳代馴化獲得，與傳統畢赤酵母菌株相比該菌株耐受高濃度甲醇和利用甲醇的能力得到大幅提升。在甲醇為唯一碳源的培養基中，馴化菌株的比生長速率與出發菌株相比至多提升1.95倍。該菌株的優良特性使其具有非常良好的工業應用前景，可廣泛用于利用廉價甲醇碳源生產酶制劑和高值化學品。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種能高效耐受和利用甲醇的酵母菌株及應用。

背景技術

甲醇作為一種古老的有機原料，是僅次于乙烯、丙烯和苯的基本有機原料，其需求與國民經濟的增長密切相關，近年來隨著中國經濟的持續增長，甲醇的需求也出現大幅增長，年均增長率保持在10％～15％，與此同時，甲醇的生產能力也在穩步提升，據權威統計，2012年中國甲醇行業共有企業近300家，產能達到5149.1萬t，產量為3129萬t。由于中國是缺油少氣、煤炭資源相對豐富的國家，隨著國家產業政策調整和技術進步，目前中國甲醇產能中以煤為原料約占66％，以天然氣為原料約占23％，以焦爐氣為原料約占11％。甲醇作為重要的基礎化工原料，在傳統下游應用，包括塑料、合成纖維、合成橡膠、膠粘劑、染料、涂料、香料、醫藥和農藥等方面有著重要的作用，近年來隨著煤化工國產化工藝技術及裝備大型化取得突破，醇醚燃料、甲醇制烯烴/芳烴等新興煤化工產業發展前景樂觀。另外，基于國際石油價格上漲和中國汽油消費量大幅增加的發展趨勢，甲醇汽油、甲醇燃料和二甲醚等新型燃料也將隨著標準的完善和銷售網絡的建設，成為甲醇新的消費增長點。隨著生產工藝的改進與社會需求的變大，甲醇的生產成本也在初步降低，2006年，中國國內均價甲醇是2936元/噸，而到2012年，已經變成了2650元/噸，目前的生產成本已經低于傳統的工業原料葡萄糖和甘油，可以預知，未來若干年，甲醇將成為十分重要的原料。

1969年，Kiochi Ogata首次報道，發現一種特別的能夠以甲醇作為唯一的碳源和能源的酵母菌，這種嗜甲醇酵母立刻引起人們極大關注。由于甲醇的經濟性，這種生物體可作為一種單細胞蛋白(Single cell protein，SCP)推向市場，成為高蛋白的動物飼料。70年代，Philips Petroleum公司發展了該菌株適應在甲醇中高密度連續培養的培養基和方法，使細胞產量高達130g干細胞/升。不幸的是，隨之而來的石油危機導致甲醇價格急劇上升，使得人們不再重視利用甲醇生產單細胞蛋白。這種酵母即為巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)，由于其細胞內含有甲醇代謝途徑所必需的酶，如乙醇氧化酶(Alcoholoxidase，AOX)、二羥丙酮合成酶(Dihydroxyacetone synzyme，DHAS)和過氧化氫酶(Catalase，CTS)等，其中AOX是甲醇代謝途徑中的十分重要的酶，也是催化甲醇代謝第一步反應的酶，它能使甲醇被氧化成甲醛和過氧化氫，過氧化氫酶又降解過氧化氫為氧氣和水，過氧化氫又進一步氧化甲醛為甲酸和CO₂，這樣通過兩種脫氫酶的作用使細胞以甲醇為唯一碳源。由于AOX與氧的親合力低，所以P.pastoris在以甲醇為唯一碳源時，會代償性產生大量的AOX，約占全部可溶性蛋白質的30％，而在以葡萄糖、甘油或乙醇作為碳源的培養細胞中則檢測不到AOX，這說明AOX基因啟動子具有明顯的調控功能,可用于調控外源基因的表達。此調控作用是由一般碳源抑制/解抑制及碳源特殊誘導雙重機制控制的：外源基因在甲醇以外的碳源中處于非表達狀態，而在培養液中加入甲醇后，外源基因即被誘導表達。一般來說，畢赤酵母在表達外源蛋白的大規模高密度發酵過程中，主要分為兩個階段，即菌體生長增殖階段和誘導外源蛋白表達階段。在菌體增殖階段，細胞通常以甘油或葡萄糖為碳源進行擴大培養，在獲得所需要的菌體密度后，再進入外源蛋白誘導表達階段。外源蛋白表達階段是以甲醇作為唯一碳源并且誘導目的蛋白表達。在這個過程中，甲醇的精確流加是確定外源蛋白表達的關鍵，流加速率過高超過了畢赤酵母對于甲醇的利用速率，就會在過程中積累高濃度的甲醇。過量的甲醇會嚴重抑制細胞活力和產物的表達，甚至可導致菌體死亡。因此，在應用上往往通過溶氧控制、甲醇離線/在線控制或甘油/甲醇混合補料等工藝來避免甲醇可能對于酵母宿主帶來的毒害。但上述工藝調控，操作復雜并會增加生產成本。因此提高菌株對甲醇的耐受性，增加甲醇的利用速率，將是解決畢赤酵母甲醇毒性的有效策略，同時也會顯著縮短酵母培養的周期，提高生產強度，降低生產成本。