[發明專利]一種基于卡拉膠寡糖的抗逆保護劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610130688.4
• 申請日: 2016-03-08
• 公開（公告）號: CN105695387A
• 公開（公告）日: 2016-06-22
• 發明（設計）人: 吳海歌;李倩;姚子昂;崔紅利;彭麗華;吳晨;高晨慧
• 申請（專利權）人: 大連大學
• 主分類號: C12N1/38
• 分類號: C12N1/38;C12N1/18;C12N1/04;C12P7/06;C12P19/14;C12R1/865
• 代理公司: 大連智高專利事務所(特殊普通合伙) 21235
• 代理人: 胡景波

技術領域

本發明涉及工業微生物脅迫耐受性領域和海洋碳水化合物生物 利用領域，涉及一種釀酒酵母抗逆保護劑。

背景技術

釀酒酵母因其卓越的產酒性能和良好的生物安全性，在生物能源 和食品醫藥領域(釀酒、發面食品、生物醫藥等)獲得了廣泛的應用。 特別是近年來，燃料乙醇作為可再生的清潔能源，其生產和使用受到 普遍關注，其中以非糧纖維素替代糧食為原料生產燃料乙醇可以有效 的解決或緩解糧食危機，緩解石油資源短缺的矛盾，同時也有利于對 環境的改善降低空氣污染。

但是，在不同工藝(批次、單級/多級連續、重復批次等)的發酵 過程中均存在包括產物抑制和底物抑制在內的環境脅迫，使細胞活性 受到不同程度的抑制，從而降低乙醇得率和發酵效率。在利用淀粉質 原料超高濃度(VeryHighGravity,VHG)乙醇發酵過程中，隨著終產 物乙醇濃度的提高，乙醇在一眾環境脅迫因子中成為最主要的脅迫因 素，酵母細胞活性被高濃度乙醇嚴重抑制甚至出現生長停滯和死亡的 現象；同步糖化發酵技術的實現需要酵母耐受高溫；以纖維素為原料 的乙醇發酵與淀粉或糖質乙醇發酵不同，利用現有技術發酵過程中很 難達到對微生物(酵母或細菌)產生抑制作用的乙醇濃度，但木質纖 維素預處理環節卻成為抑制物主要來源，如弱酸類物質(乙酸)、呋喃 醛類等，同時酵母菌會出現氧化脅迫特征。因此，提高釀酒酵母的抗 逆性，進而提高細胞活性，獲得高乙醇得率和發酵效率具有重要意義。

卡拉膠(Carrageenan)是從麒麟菜、石花菜、鹿角菜等紅藻類 海草中提煉出來的親水性膠體，來源廣泛，制備容易。它的化學結構 是由半乳糖及脫水半乳糖所組成的多糖類硫酸酯的鈣、鉀、鈉、銨鹽。 卡拉膠作為一種結構獨特的硫酸多糖，被證明在抗病毒、抗潰瘍、抗 凝血等方面具有較理想的藥理活性，但其應用于微生物抗逆保護劑還 未有報道。因卡拉膠存在粘度大、擴散困難等問題而很難被機體吸收， 因此卡拉膠寡糖有更廣泛的應用前景。卡拉膠寡糖是卡拉膠的降解產 物,分子量較小,溶解性較好,易于吸收,穩定性和安全性都有所 改善,同時因分子鏈上的活性基團充分暴露,使其活性較卡拉膠顯著 提高,拓寬了卡拉膠的應用領域。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種基于卡拉膠寡 糖的抗逆保護劑及其制備方法和應用。

本發明涉及一種卡拉膠寡糖的抗逆保護劑，包括卡拉膠寡糖和溶 劑，所述卡拉膠寡糖的質量濃度為1μg/mL-10mg/mL。所述的卡拉 膠寡糖單體為二糖結構(1→3)-4-硫酸基-β-D半乳糖-(1→4)-3,6- 內醚-α-D-半乳糖，平均聚合度(以二糖單位計)為2-6，平均分子量 為800-2200之間。

進一步的，所述溶劑為本領域的任意常規的溶劑，如水或緩沖液， 緩沖液比如檸檬酸鹽緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液，水優選去離子水。

所述的抗逆保護劑的制備方法如下：將卡拉膠寡糖降解菌接種到 液體培養基中，待菌株穩定后，取發酵液離心，取上清液即為粗酶液； 將質量濃度為0.5％的卡拉膠與粗酶液、蒸餾水按照體積比為2:1:1 混合，于35℃氣浴搖床上震蕩，降解36-48小時，降解卡拉膠寡糖 溶解在溶液中，經透析、干燥獲得卡拉膠寡糖粉末，得到抗逆保護劑。

所述液體培養基為(w/v)：k-卡拉膠0.1％，蛋白胨0.4％，硫酸 亞鐵0.001％，加陳海水適量，陳海水是將海水經脫脂棉過濾得到。

發明人將所述的抗逆保護劑在釀酒酵母抗逆保護中，起到了良好 的技術效果，所述的抗逆保護應用包括但不限于在釀酒酵母保藏、發 酵及抗脅迫條件下的應用，抗脅迫條件包括高濃度乙醇、高滲、高鹽、 高溫、氧化脅迫、凍融脅迫等所有抑制細胞活性和存活率的不利條件。

進一步的，所述抗逆保護中的應用，其應用方式可以為將抗逆保 護劑添加至含釀酒酵母的培養基或緩沖液中，再離心除去抗逆保護劑。 更好的，將抗逆保護劑添加至含釀酒酵母的培養基或緩沖液中與釀酒 酵母共培養0.5-3小時后，再離心除去抗逆保護劑。

進一步的，所述抗逆保護中的應用，其應用方式還可以為將所述 的抗逆保護劑添加至含釀酒酵母的培養基中，直至發酵終點。

所述的抗逆保護劑的使用量可根據不同實際需要進行調整，卡拉 膠寡糖在離子水中或緩沖液中的濃度比較適宜的范圍為1μg/mL-10 mg/mL。