[發(fā)明專利]人細胞系中重組人蛋白質(zhì)的無血清穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610127579.7
• 申請日: 2006-06-29
• 公開（公告）號: CN105755041A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 卡羅拉·施羅德;卡特倫·韋格曼;丁海燕
• 申請（專利權(quán)）人: 奧克塔法馬股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12;C12R1/91
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

本申請是申請?zhí)枮?00680023280.1、發(fā)明名稱為“人細胞系中重組人蛋白質(zhì)的無血清穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和生產(chǎn)”的申請的分案申請，該母案申請是2006年6月29日提交的PCT申請PCT/EP2006/063705進入中國國家階段的申請.

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及無血清生產(chǎn)永生化人細胞系的改進方法，所述細胞系在無血清條件下穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了帶有編碼目的蛋白的基因的特定載體。另外，本發(fā)明涉及通過所述方法獲得的生產(chǎn)細胞系，使用所述生產(chǎn)細胞系生產(chǎn)所述目的蛋白的方法以及自身攜帶目的基因的特定載體。

背景技術(shù)

人蛋白質(zhì)的重組生產(chǎn)一般是通過培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的真核(優(yōu)選哺乳動物)細胞系并從培養(yǎng)液中分離所述蛋白質(zhì)來進行。當(dāng)所述重組蛋白旨在用于藥物應(yīng)用時，長期以來的一般實踐是使用非人細胞系，以避免共純化可能被人細胞接納并表達的傳染原的風(fēng)險。

在一些人蛋白質(zhì)如人凝血因子VIII的生產(chǎn)中，發(fā)現(xiàn)使用非人細胞系具有某些缺點，例如所表達蛋白質(zhì)進入培養(yǎng)基的分泌水平不夠理想。相信這是由于不同哺乳動物細胞類型之間有關(guān)細胞內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯和修飾途徑的微小差別，這也可能影響所表達多肽的生物活性。除此之外，還存在這種擔(dān)心：從非人表達系統(tǒng)中純化的治療性蛋白質(zhì)被可在患者中引起抗原反應(yīng)的細胞成分污染。另一個擔(dān)心是在非人表達系統(tǒng)中重組生產(chǎn)的人蛋白質(zhì)上發(fā)現(xiàn)的非人糖基化模式。人們認(rèn)為這增加了患者中發(fā)生抗原反應(yīng)的可能性。另外，血液蛋白質(zhì)(例如凝血因子)的生物穩(wěn)定性和效力受其N-糖基化模式的顯著影響。尤其是外周及末端單糖是很重要的，因為它們被負責(zé)降解它們的細胞的特定受體所檢測。例如，凝血因子帶有唾液酸殘基作為末端單糖。對糖蛋白觸角(antennae)中唾液酸組成的修飾可導(dǎo)致異源糖基化模式。因此，修飾的發(fā)生與生物穩(wěn)定性和效力高度相關(guān)。因此，在重組凝血因子的生產(chǎn)中，評估非人生產(chǎn)細胞系與人細胞系相比糖基化的影響是重要的考慮因素。另一方面，用于所需基因高水平蛋白質(zhì)表達的一般方法是可用的，其包括表達病毒轉(zhuǎn)錄激活子蛋白的永生化穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞系(例如，美國專利5,712,119)。這些細胞系可使用載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)化，其中合適的病毒轉(zhuǎn)錄啟動子與定義目的基因的DNA序列有效連接，由細胞系提供的轉(zhuǎn)錄激活子蛋白激活病毒轉(zhuǎn)錄啟動子，由此起始目的基因的表達。