[發明專利]人細胞系中重組人蛋白質的無血清穩定轉染和生產

在審

• 申請號: 201610127579.7
• 申請日: 2006-06-29
• 公開（公告）號: CN105755041A
• 公開（公告）日: 2016-07-13
• 發明（設計）人: 卡羅拉·施羅德;卡特倫·韋格曼;丁海燕
• 申請（專利權）人: 奧克塔法馬股份有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12;C12R1/91
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 彭鯤鵬;盧蓓

1.制備穩定轉染了核酸序列的永生化人細胞系的方法，所述核酸序列包含編碼人靶蛋白質或其衍生物或突變體的基因、啟動子和牛生長激素多聚腺苷酸化(多聚A)信號，所述啟動子和多聚A信號分別與所述人靶蛋白質編碼基因的5’和3’末端連接，所述方法包括在無血清條件下使用包含所述核酸序列和復制起點的轉染載體轉染永生化人宿主細胞系。

2.權利要求1的方法，其中所述人靶蛋白質是人血漿蛋白質，其選自凝血因子例如因子IX、因子VIII(野生型和B結構域缺失的)、因子VII/VIIa和血友病因子(vWF)；生長因子例如紅細胞生成素等；集落刺激因子(CSF)例如粒細胞刺激因子(G-CSF)、巨噬細胞CSF(M-CSF)和粒細胞-巨噬細胞CSF(GM-CSF)；細胞因子例如白介素；蛋白酶抑制劑例如α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)和糜蛋白酶；轉運蛋白例如激素；抑制或調節作用蛋白；及其衍生物和突變體，優選地，所述人蛋白質選自因子IX、因子VIII(包括野生型因子VIII和B結構域缺失的因子VIII)、因子VII/VIIa、G-CSF、vWF和A1AT，最優選地，所述人蛋白質是如SEQIDNO:1的939-2324位堿基對所編碼的凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位堿基對所編碼的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型因子VIII、如SEQIDNO:3的783-5162位堿基對所編碼的B結構域缺失的人因子VIII、如SEQIDNO：13和14所編碼的因子VII/VIIa、如SEQIDNO：15、16和17中所編碼的G-CSF或者如SEQIDNO：18所編碼的vWF。

3.權利要求1或2的方法，其中在所述轉染載體中，

(i)啟動子選自病毒啟動子、看家基因啟動子和組織特異性啟動子，優選地，所述啟動子是帶有或不帶內含子A的CMV啟動子、SV40啟動子、EF-1α啟動子、HSVTK啟動子等，最優選地，所述啟動子是CMV啟動子；和/或

(ii)復制起點允許所述質粒在細菌中復制和擴增；

(iii)所述載體還帶有至少一個選擇標記基因，優選所述選擇標記選自潮霉素抗性、新霉素抗性、氨基糖苷磷酸轉移酶(neo、G418、APH)抗性、博來霉素(phleo、bleo、zeocin)抗性和黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(XGPRT、gpt)抗性，和/或所述基因處于如上文(i)中定義的啟動子的控制下；和/或

(iv)所述載體還帶有一個或多個其他調節元件，所述調節元件優選選自剪接位點、重組位點、多聚A位點、增強子、多克隆位點和原核質粒序列。

4.權利要求3的方法，其中所述轉染載體帶有CMV啟動子、潮霉素基因、多聚A序列和目的基因，并優選來源于具有SEQIDNO:4或5所示序列的pcDNA3.1載體。

5.根據權利要求1-4中任一項的方法，其中所述永生化人細胞系

(i)能夠在無血清條件下轉染和培養；和/或

(ii)已在其基因組中整合了腺病毒序列；和/或

(iii)選自腎、膀胱、肝、肺、心肌、平滑肌、卵巢和胃腸細胞，優選人腎細胞系；和/或

(iv)不能表達人朊病毒蛋白。

6.根據權利要求5的方法，其中所述腎細胞是人胚腎細胞，優選地，所述人胚腎細胞選自293細胞(ATCCCRL-1573；DSMACC305)、293T細胞(DSMACC2494)、FreeStyle293細胞(293F細胞；InvitrogenR79007)，優選為293F細胞(InvitrogenR79007)。

7.權利要求6的方法，其中所述細胞系是293F，所述轉染載體來源于pcDNA3.1，所述載體優選編碼如SEQIDNO:1的939-2324位堿基對所示的人凝血因子IX、如SEQIDNO:2的973-2259位堿基對所編碼的人A1AT、如SEQIDNO:9中所示的野生型人因子VIII，或者如SEQIDNO:3所示的B結構域缺失的人因子VIII、FVII/FVIIa、G-CSF、包括SEQIDNO：27中所示的G-CSFb，或者血友病因子。

8.根據權利要求1-7中任一項的方法，其中所述無血清轉染在無血清的懸浮培養物中使用陽離子轉染試劑或磷酸鈣進行，優選使用脂轉染胺2000CD試劑(Invitrogen)。