[發明專利]一種蘋果褪綠葉斑病毒檢測試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 201610125355.2
• 申請日: 2016-03-07
• 公開（公告）號: CN105543417A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 魏芳
• 申請（專利權）人: 魏芳
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種蘋果褪綠葉斑病毒檢測試劑盒，其特征在于包括4條特 異性引物：外引物F3，其序列如SEQIDNO:1所示；外引物B3，其 序列如SEQIDNO:2所示；內引物FIP，其序列如SEQIDNO:3所示； 內引物BIP，其序列如SEQIDNO:4所示。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其進一步包括反應緩沖液、 AMV逆轉錄酶、BstDNA聚合酶和核酸染料。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其中所述反應緩沖液由10mM dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、5mM甜菜堿和50mMMgSO₄組 成。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其中所述核酸染料為SYBR GreenI。

5.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其進一步包括RNA提取 試劑以及陽性對照和陰性對照。

6.一種蘋果褪綠葉斑病毒檢測方法，其包括以下步驟：

(1)提取待測樣品RNA；

(2)設計并合成引物；

(3)建立25μl的RT-LAMP反應體系，其包括5pmol/μl的外引物 F31μl、5pmol/μl的外引物B31μl、40pmol/μl的內引物FIP1μl、 40pmol/μl的內引物BIP1μl、反應緩沖液2.5μl、2UAMV逆轉錄酶1μl、 8UBstDNA聚合酶1μl、模板DNA2μl，加水補充至25μl，并以蘋果 褪綠葉斑病毒基因組DNA作為陽性對照，以100mMTris-HClpH8.0 和50mMEDTA作為陰性對照；

(4)LAMP反應：將步驟(3)中PCR管于63℃恒溫反應60min；

(5)分析判斷反應產物結果：在(4)中所得反應產物中加入1μl 核酸染料，根據反應液的顏色判斷是否存在蘋果褪綠葉斑病毒。

7.根據權利要求6所述的檢測方法，其中所述外引物F3的序列如 SEQIDNO:1所示，外引物B3的序列如SEQIDNO:2所示，內引物FIP 的序列如SEQIDNO:3所示，內引物BIP的序列如SEQIDNO:4所示。

8.根據權利要求6所述的蘋果褪綠葉斑病毒RT-LAMP檢測方 法，其中所述反應緩沖液由10mMdNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、 5mM甜菜堿和50mMMgSO₄組成。