[發(fā)明專利]基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒及其檢測方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610117802.X
• 申請(qǐng)日: 2016-03-02
• 公開（公告）號(hào): CN105671038A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林華月;白永穎;方宜臻;張忠英
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院;張忠英
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/68
• 代理公司: 廈門南強(qiáng)之路專利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

1.生物標(biāo)記物miR-19a，其特征在于其核苷酸序列為：

5'-UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA-3'(SEQIDNO：1)。

2.基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒，其特征在于設(shè)有盒體、隔板、 外源性參照瓶、頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶；隔板設(shè)在盒體內(nèi)，外源性參 照瓶、頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶插在隔板上，外源性參照瓶內(nèi)裝有外源 性參照，頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑瓶內(nèi)裝有頸環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑，實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑瓶內(nèi)裝有實(shí)時(shí)熒 光定量PCR試劑。

3.如權(quán)利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒，其特征在 于所述外源性參照采用cel-miR-39，所述cel-miR-39為一類線蟲類miRNA,其核苷酸序列為 5'-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3'(SEQIDNO：2),其工作濃度可為5nmol/L。

4.如權(quán)利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒，其特征在 于所述莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄試劑包括以下組份：200U/μL的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶、10mmoldNTPs混合液、 5×RT緩沖液、40U/μL的RNA酶抑制劑、1μmol的特異miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物；所述5×RT 緩沖液由250mmolTris-HCl，375mmolKCl，15mmolMgCl₂，50mmolDTT組成。

5.如權(quán)利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒，其特征在 于所述特異miRNA逆轉(zhuǎn)錄引物由miR-19a的特異逆轉(zhuǎn)錄引物、外源性參照cel-miR-39的特 異逆轉(zhuǎn)錄引物和內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物組成：

所述miR-19a的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：

5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGTTT- 3'(SEQIDNO:3)；

所述外源性參照cel-miR-39的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：

5'-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACCAAGCTG A-3'(SEQIDNO:4)；

所述內(nèi)源性參照U6的特異逆轉(zhuǎn)錄引物的核苷酸序列為：

5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'(SEQIDNO:5)。

6.如權(quán)利要求2所述基于AllGlo探針熒光定量PCR的miR-19a檢測試劑盒，其特征在 于所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑包括以下組份：10×Taq緩沖液、10mmol的MgCl₂、5U/μL的 Taq聚合酶、10mMdNTP混合液、100ml無核酶水、10μmol正向引物、10μmol反向引物和AllGlo 探針；所述10×Taq緩沖液包括100mmolTris-HCl，500mmolKCl。