[發明專利]革蘭氏陽性菌菌影的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201610116309.6
• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105784984B
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 鞠興榮;都立輝;吳學友;袁建;何榮;陳正行
• 申請（專利權）人: 南京財經大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20
• 代理公司: 南京匯盛專利商標事務所(普通合伙)32238
• 代理人: 袁靜

技術領域

本發明屬于微生物學和免疫學領域，具體涉及革蘭氏陽性菌菌影的制備方法。

背景技術

細菌菌影(Bacterial Ghost)是一種沒有細胞漿和核酸的空細菌體，它保留了細菌結構的完整性,保留了原菌體表面抗原決定簇，因此可以用于免疫動物后篩選針對該細菌的抗體，以開發能夠高效、快速檢測該細菌的抗體。目前，國內外在細菌菌影的研究方面，大多采用基于噬菌體ΦX174裂解基因E的裂解系統的生物技術手段，而且針對的是革蘭氏陰性細菌，如：大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸炎沙門氏菌、流感嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、幽門螺旋桿菌、肺炎克雷伯氏桿菌、溶血巴氏桿菌、多殺巴氏桿菌、霍亂弧菌、綠膿桿菌、惡臭假單胞菌等。然而，該方法對于革蘭氏陽性菌菌影的制備并不適用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用簡單化學試劑就可以快速、高效制備革蘭氏陽性菌菌影的方法。

革蘭氏陽性菌菌影的制備方法，包括如下步驟：

(1)在革蘭氏陽性菌懸液中加入NaOH、SDS和CaCO₃，在30-40℃條件下孵育，離心，收集沉淀，洗滌后制成重懸液A；

(2)在所述重懸液A中加入H₂O₂，在30-40℃條件下孵育，離心，收集沉淀，洗滌后制成重懸液B；

(3)將重懸液B在20-30℃條件下孵育，離心，收集沉淀，洗滌，得到革蘭氏陽性菌菌影。

優選的技術方案中，步驟(1)中革蘭氏陽性菌懸液中加入的NaOH的終濃度為20-40mmol/L，加入的SDS的終濃度為0.1-0.3mmol/L，每升革蘭氏陽性菌懸液中CaCO₃的加入量為9-11mmol；步驟(1)中，懸液孵育時在80-120r/min條件下振搖，孵育時間為40-60min。

優選的技術方案中，，步驟(2)中所述重懸液A中加入的H₂O₂的最終質量濃度為0.02-0.05％；步驟(2)中，懸液孵育時在80-120r/min條件下振搖，孵育時間為20-40min。

優選的技術方案中，步驟(3)中，所述重懸液B孵育時在30-50r/min條件下振搖，孵育時間為20-40min.

優選的技術方案中，采用生理鹽水進行洗滌。

優選的技術方案中，步驟(2)中重懸液B是將所述沉淀重懸于55-65％的乙醇水溶液中所得。

優選的技術方案中，所述重懸液A是將所述沉淀重懸于水后所得。

優選的技術方案中，所述革蘭氏陽性菌為單增李斯特菌。

優選的技術方案中，所述革蘭氏陽性菌懸液的OD₆₀₀為0.3～0.5。

本發明還提供上述方法制備的菌影在制備用于檢測所述革蘭氏陽性菌的抗體方面的應用。

本發明利用簡單化學試劑就可以快速、高效制備革蘭氏陽性菌菌影，顯著降低了生產成本。單核細胞增生李斯特菌(縮寫為單增李斯特菌，Listeria monocytogenes)是一種危險性嚴重的病原菌，可以導致嚴重的人畜共患傳染病，如腦膜炎、敗血癥、流產和單核細胞增多等癥狀，由它引起的李斯特菌病致死率超過25％。由于單增李斯特菌菌影保留了細菌結構的完整性,尤其是保留了原菌體表面抗原決定簇，免疫后能夠產生針對單增李斯特菌的抗體，從而篩選到能夠高效、快速檢測該細菌的抗體。

附圖說明

圖1單增李斯特菌菌影的SEM觀察結果，圖A中觀察對象為單增李斯特菌活細胞，圖B中觀察對象為單增李斯特菌菌影。

圖2單增李斯特菌菌影的TEM觀察結果，圖A中觀察對象為單增李斯特菌活細胞，圖B中觀察對象為單增李斯特菌菌影。

圖3單增李斯特菌菌影免疫小鼠產生的抗體效價。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，絕不限制本發明的保護范圍。在該部分選取食源性革蘭氏陽性菌單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)作為實施例進行具體說明。

實施例1制備單增李斯特菌菌影

1.菌體培養與收集