[發(fā)明專利]基于代謝物及基因表達篩選三七皂苷合成關鍵基因的方法

在審

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• 申請日: 2016-03-01
• 公開（公告）號: CN105671159A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設計）人: 齊煉文;陸續(xù);王寧;李萍
• 申請（專利權）人: 中國藥科大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明涉及三七中三萜皂苷合成途徑關鍵基因的篩選，具體的是結(jié)合一年生三七 代謝物含量及三萜皂苷合成途徑關鍵基因的表達量進行典型關聯(lián)分析(canonical correlationanalysis)，篩選出三七中對皂苷含量貢獻度較大的三萜皂苷合成途徑關鍵 基因。

背景技術

三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)為五加科人參屬植物，是我國傳統(tǒng)珍 貴藥材，其主要生理活性成分為三七皂苷。三七的應用在古代主要作為金創(chuàng)要藥，用于體內(nèi) 外各種出血及跌打損傷、瘀滯腫痛的治療。現(xiàn)代藥理學研究表明三七總皂苷和部分單體皂 苷在血液及心血管系統(tǒng)、系統(tǒng)代謝、免疫及抗炎、抗腫瘤等方面均有較好的生理活性，其多 方面的藥理作用及保健功能越來越受到人們的重視。目前三七皂苷的主要來源是從栽培三 七提取得到的，然而三七為多年生草本植物，生長周期長，且生長條件苛刻、地理分布窄，加 之病蟲害嚴重、連作障礙、農(nóng)藥殘留等問題，其產(chǎn)量已難以滿足快速增長的市場需求。

近年來，針對藥用植物次生代謝產(chǎn)物的基因調(diào)控已成為分子生物學研究的熱點， 而皂苷類物質(zhì)是植物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分，其含量和組成主要取決于生物合成關 鍵基因在細胞中的表達水平。在植物細胞中，萜類化合物主要來源于兩個前體物質(zhì)，異戊烯 基焦磷酸(IPP)及其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。細胞質(zhì)中的甲羥戊酸(MVA)途徑 和質(zhì)體中的2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑都能夠產(chǎn)生IPP和DMAPP，且兩條途徑 所產(chǎn)生的IPP可以穿過質(zhì)體膜互為對方所用。IPP分子和兩個DMAPP分子在法尼基焦磷酸合 酶(FPS)的作用下生成法尼基焦磷酸(FPP)，兩個FPP分子在鯊烯合酶(SQS)的作用下以頭- 頭方式還原偶聯(lián)生成三萜類物質(zhì)的前體鯊烯。隨后，鯊烯在鯊烯環(huán)氧酶(SE)的作用下氧化 成2，3-氧化鯊烯，達瑪烷二醇合成酶(DS)催化2，3-氧化鯊烯環(huán)化為達瑪烯二醇。達瑪烯二 醇是達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷類的骨架，在細胞色素P450單加氧酶及多種糖基轉(zhuǎn)移酶的作用 下最終形成不同類型的達瑪烷型四環(huán)三萜皂苷。目前，植物三萜皂苷合成途徑中的一些關 鍵酶基因已在人參屬植物中克隆和鑒定，研究證實它們的表達對三萜皂苷合成起著重要調(diào) 控作用。此外，Niu等人對FPS，SS，SE和DS等基因在四年生三七開花期的表達進行了分析，為 進一步闡明皂苷類物質(zhì)在三七中的合成機制打下了基礎。

本發(fā)明以探索三七中三萜皂苷合成關鍵酶基因表達水平和代謝物含量的關聯(lián)性 為出發(fā)點，應用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對一年生三七不同部位的代謝物含量進行了 分析，同時利用熒光定量PCR技術對其皂苷合成途徑關鍵酶基因表達量進行定量分析，并且 通過典型關聯(lián)分析構(gòu)建了三七基因-代謝物相關圖，對關鍵基因進行了篩選。在本發(fā)明之 前，尚未出現(xiàn)涉及基于三萜皂苷含量及其合成途徑關鍵基因表達量對三七三萜皂苷合成關 鍵基因進行篩選的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于構(gòu)建三七生長發(fā)育早期皂苷合成關鍵基因和代謝物含量的關 系網(wǎng)絡，篩選三七植物中對皂苷合成有重要作用的關鍵基因。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供的技術方案包括下列步驟：

1)分析一年生三七不同部位皂苷類物質(zhì)代謝輪廓。

2)測定皂苷合成途徑關鍵基因在三七不同部位的表達。

3)構(gòu)建基因-代謝物關系網(wǎng)絡，篩選三七中皂苷合成關鍵基因。

上述方法中，所述三七不同部位為一年生三七的葉、葉柄及根部。

步驟1)所述分析皂苷類物質(zhì)代謝輪廓是采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)對不同 部位樣品甲醇提取物進行檢測，使用內(nèi)標法通過標準曲線進行定量。分析方法參照Li等人 “GlobalanalysisofchemicalconstituentsinShengmaiinjectionusinghigh performanceliquidchromatographycoupledwithtandemmassspectrometry”論文 中報道的皂苷定量方法。