[發(fā)明專利]特異性結(jié)合前列腺癌的短肽PCP12及其應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610112636.4
• 申請日: 2014-03-24
• 公開（公告）號: CN105646666A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設計）人: 華國光
• 申請（專利權(quán)）人: 朱育盼
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 北京高航知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11530
• 代理人: 趙永強

技術領域

本發(fā)明屬于蛋白質(zhì)多肽技術領域，具體涉及一系列可特異性結(jié)合前列腺癌的 短肽。

背景技術

前列腺癌是嚴重威脅中老年男性健康的惡性腫瘤之一，而且發(fā)病率逐年上 升，死亡率高，僅次于肺癌，位居第二。50多年以來，雄激素阻斷治療一直是 前列腺癌的標準療法，然而，大多數(shù)患者最終會發(fā)展為激素抵抗性前列腺癌 (hormonerefractoryprostatecancer,HRPC)。對于HRPC，目前尚無有效的療法， 而現(xiàn)有治療手段包括放射治療、化學治療等均不能延長患者生命達一年以上。因 此探索新型有效的前列腺癌治療方法，一直是泌尿外科臨床所面臨的重要課題之 一。

目前我國對于前列腺癌的篩查率相對較低，這也是造成前列腺癌死亡率偏高 的重要原因之一。因此，本領域迫切需要開發(fā)可用于前列腺癌診斷的相關蛋白。 而多肽因分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對細胞表面受體具有較高親和 力而成為靶向傳遞研究中的理想配體。然而已知的天然受體-配體對是非常有限 的。

噬菌體展示肽庫技術的發(fā)展則為發(fā)現(xiàn)和表征新的配體及對應受體提供了有 力的工具，不僅有望實現(xiàn)臨床應用于腫瘤的靶向治療，也有助于解釋疾病發(fā)生機 制的理論研究。噬菌體展示技術通過將特定片段插入噬菌體DNA中而將相應的 多肽表達在pIII衣殼蛋白上，從而在噬菌體的DNA和衣殼蛋白之間搭建橋梁， 使得各種靶分子的多肽配體可通過體外或體內(nèi)篩選得以快速鑒定。發(fā)展至今，應 用此技術已成功篩選得到針對肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等多種人類腫瘤的靶向多肽， 但是對于篩選前列腺癌靶向配體的相關報道則很少。

因此，本發(fā)明利用噬菌體展示肽庫技術于前列腺癌腫瘤模型體內(nèi)篩選得到 16條可靶向前列腺癌的短肽，并對此多肽的靶向特性進行了鑒定，以考察其作 為靶向配體用于傳遞藥物至前列腺腫瘤部位的可行性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一系列利用噬菌體展示肽庫技術 篩選得到的具有靶向前列腺癌特性的多肽。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述多肽在制備前列腺癌診斷試劑盒中的應用。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案予以實現(xiàn)：

用噬菌體展示肽庫減性篩選腫瘤細胞特異性結(jié)合多肽或靶肽的方法為：通常 用兩個細胞系進行篩選，將噬菌體展示隨機肽庫先通過不含靶抗原的正常細胞篩 選，未結(jié)合的上清再通過含靶抗原的細胞，篩選出噬菌體擴增后進行下一輪篩選， 最終得到特異性結(jié)合肽。

首先，采用上述噬菌體展示肽庫減性篩選技術，以前列腺癌LNCaP和PC3 細胞作為靶細胞，正常細胞為吸附細胞，對NEWENGLANDBiolabs的 Ph.D.-7^TMPhageDisplayPeptideLibraryKit進行四輪體外篩選，通過逐輪增強洗 滌力度，獲得了前列腺癌特異性的噬菌體克隆。上述的篩選后，分別于第二輪、 第三輪和第四輪篩選結(jié)果中隨機挑取單克隆進行DNA的提取和測序。應用生物 信息學工具分析篩選得到的多肽序列，同時酶聯(lián)免疫吸附實驗用于分析候選噬菌 體單克隆對細胞的結(jié)合能力，從而鑒定出與前列腺癌細胞具有較強的親和力的噬 菌體16個克隆，將該16個克隆送去測序，并分別命名為PCP1-16，測序結(jié)果證 實PCP1-16的氨基酸序列分別如SEQIDNO：1-16所示。

本發(fā)明篩選得到的多肽經(jīng)鑒定具有以下特性及優(yōu)點：

多肽可有效地識別并特異性結(jié)合前列腺癌細胞系LNCaP和PC3，而對正常 的前列腺細胞系RWPE-1，及其他腫瘤細胞HepG2、A549、SW480的結(jié)合能力 弱，表現(xiàn)出針對前列腺癌特異的識別和結(jié)合能力；

該多肽具有分子量小，組織穿透性好，無免疫原性且對細胞表面受體具有較 高親和力的普遍特點，該多肽可用于制備前列腺癌診斷試劑藥盒，該試劑盒診斷 靈敏度高、特異性高，可用于前列腺癌高危人群的普查及前列腺癌的早期臨床診 斷、以及治療效果的評價與病人病情轉(zhuǎn)歸、預后的判斷。

附圖說明

圖1為ELISA檢測第四輪篩選噬菌體克隆與LNCaP和PC3的親和力對比柱 狀圖；