[發(fā)明專利]一種煙葉中所含角鯊烯的高效液相色譜檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610110939.2
• 申請日: 2016-02-29
• 公開（公告）號: CN105738524A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳澤鵬;陳楨祿;李燕垣;萬樹青;張紀(jì)利
• 申請（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司廣東省公司;廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司;華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及煙葉中成分的檢測技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種煙葉中所含角鯊烯的高效液相色譜檢測方法。

背景技術(shù)

角鯊烯最初是從鯊魚的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱為2,6,10,15,19,23--六甲基--2,6,10,14,18,22--二十四碳六烯，屬開鏈三萜類化合物。角鯊烯具有提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化性和免疫能力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能,是一種無毒性的具有防病治病作用的生物活性物質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)角鯊烯對人體還具有解毒作用，可移除組織中的脂溶性毒素。2014年4月，國家煙草專賣局下發(fā)“關(guān)于”加快卷煙降焦減害技術(shù)成果推廣應(yīng)用的通知(國煙辦綜[2014]218號)，提出要加大卷煙減害技術(shù)重大專項(xiàng)研究成果的應(yīng)用推廣力度，要采取針對性技術(shù)措施加快卷煙降焦減害步伐。

本申請人在煙葉天然抗氧化劑角鯊烯的生態(tài)累積與減害的研究工作，發(fā)現(xiàn)角鯊烯可以選擇性地降低煙氣中苯并芘、巴豆醛、NH3等有害成分，降低卷煙危害指數(shù)，同時角鯊烯具有清除煙氣中的氣相和固相自由基功能由于角鯊烯具有獨(dú)特生理功能，目前開發(fā)利用角鯊烯已成為科技界研究的熱點(diǎn)。

但是，目前國內(nèi)外還沒有可參考的煙葉中角鯊烯定性和定量的檢測方法，因此，在煙草行業(yè)建立烤煙中角鯊烯定性和定量的檢測方法具有前瞻性，也是十分必要的。而在煙葉中角鯊烯的檢測中，良好的樣品前處理方法對獲得準(zhǔn)確科學(xué)的檢測結(jié)果起到關(guān)鍵性作用。在確定的檢測條件下，采用不同提取劑提取樣品中角鯊烯，其提取效率、提取操作用時等因素都是必須考慮的重要因素，各個因素之間又是相互影響的關(guān)系，目前未見基于高效液相色譜法檢測煙葉中角鯊烯的樣品前處理研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是填補(bǔ)現(xiàn)有煙葉中角鯊烯的檢測技術(shù)不足，尤其是適于高效液相色譜法檢測煙葉中角鯊烯的樣品前處理方法的不足，提供一種煙葉中所含角鯊烯的高效液相色譜檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明以甲醇和乙腈為流動相，采用填有粒徑5μm的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)，將經(jīng)本發(fā)明方法前處理后的樣品注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測器檢測角鯊烯。

具體地，提供一種煙葉中所含角鯊烯的高效液相色譜檢測方法，包括以下步驟：

S1.樣品經(jīng)前處理得到樣品液，將樣品液經(jīng)凈化劑凈化處理后得到樣品待測液；

S2.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；

S3.檢測：吸取樣品待測液注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測器檢測角鯊烯；

其中，步驟S1所述樣品前處理包括以下步驟：

S11.煙葉切絲，取煙絲加入三氯甲烷超聲提取30～60分鐘，收集提取液，用三氯甲烷沖洗提取后的煙絲，合并提取液和沖洗液；

S12.將步驟S11所得合并的提取液和沖洗液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用正己烷溶解，經(jīng)第二次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，用色譜級乙腈溶解，過0.22μm有機(jī)系濾膜得樣品液；

步驟S3所述檢測的條件為：

Agilent1100高效液相色譜儀HPLC配紫外檢測器；

色譜柱：C18，5μm，4.6×250mm；

柱溫：30℃；

流動相類型：甲醇∶乙腈，體積比為75/25；

流動相流速：1mL/min；

檢測波長為：210nm；

進(jìn)樣量：10μL。

優(yōu)選地，步驟S2所述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法是準(zhǔn)確稱取0.1g角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至0.0001g，用乙腈溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻即得。

優(yōu)選地，步驟S2所述角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立的方法是：采用系列稀釋法，分別配制成濃度為0.002、0.01、0.05、0.2、0.5mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液相色譜進(jìn)樣檢測；以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出角鯊烯濃度與相應(yīng)峰面積的線性回歸方程。

優(yōu)選地，步驟S11在加入三氯甲烷之前，先對煙絲進(jìn)行渦旋處理，所述渦旋處理是渦旋1min，靜止10min。

優(yōu)選地，所述渦旋處理的條件為2000r/min。

優(yōu)選地，步驟S11所述三氯甲烷的用量按照與煙絲的比例為1.0g煙絲：30mL三氯甲烷確定。

優(yōu)選地，步驟S11所述超聲提取重復(fù)3次。

優(yōu)選地，步驟S11所述超聲提取的超聲波功率為500w。

優(yōu)選地，所述超聲處理的時間為30min。