[發明專利]一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610107596.4
• 申請日: 2016-02-26
• 公開（公告）號: CN106610378A
• 公開（公告）日: 2017-05-03
• 發明（設計）人: 苗進超
• 申請（專利權）人: 弗雷米德生物醫藥技術（天津）有限公司
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N33/68
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產權代理有限公司12211
• 代理人: 張會雪

1.一種HPV16型E7蛋白檢測的化學發光板，其特征在于：該化學發光板包被有HPV16型E7抗體。

2.根據權利要求1所述的一種HPV16型E7蛋白檢測的化學發光板，其特征在于：該化學發光板的每個微孔內抗體的包被量為0.05～0.5μg。

3.權利要求1或2所述化學發光板的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na₂CO₃ 1.59g/L，NaHCO₃ 2.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na₂HPO₄1.44g/L、KH₂PO₄ 0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Tween-20 0.5ml/L、proclin3000.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na₂HPO₄ 1.44g/L、KH₂PO₄ 0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、BSA 10g/L、sucrose 25g/L、proclin300 0.3ml/L)，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。

4.一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括：

包被有HPV16型E7抗體的化學發光板：化學發光板的每個微孔內抗體的包被量為0.05～0.5μg；

HRP標記的HPV16型E7抗體：濃度為0.05～0.4μg/ml。

5.根據權利要求4所述的HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，其特征在于：所述的試劑盒還包括人體宮頸脫落細胞裂解液。

6.根據權利要求5所述的HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，其特征在于：所述的人體宮頸脫落細胞裂解液包括：0.05％～1％表面活性劑；10mM～1M緩沖液；1mM～10mM蛋白酶抑制劑。

7.根據權利要求6所述的HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，其特征在于：所述的表面活性劑為Tween 20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上；所述的緩沖液為phosphate-buffered saline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上。

8.根據權利要求4-7任一項所述的HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒，其特征在于：所述的包被有HPV16型E7抗體的化學發光板的制備方法，包括如下步驟：取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na₂CO₃ 1.59g/L，NaHCO₃ 2.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na₂HPO₄ 1.44g/L、KH₂PO₄0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Tween-20 0.5ml/L、proclin300 0.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na₂HPO₄ 1.44g/L、KH₂PO₄ 0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、BSA 10g/L、sucrose 25g/L、proclin300 0.3ml/L)，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存。

9.一種HPV16型E7蛋白的檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

1)、制備包被HPV16型E7抗體的化學發光板

取HPV16型E7抗體，按100μL/孔將包被液(包被液：抗體0.5～5mg加入包被緩沖液1000ml；包被緩沖液：Na₂CO₃ 1.59g/L，NaHCO₃ 2.93g/L)加入微孔內，4℃過夜(16～18h)；采用洗滌液(Na₂HPO₄ 1.44g/L、KH₂PO₄ 0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、Tween-200.5ml/L、proclin300 0.3ml/L)進行洗滌，300μL/孔，洗滌五次；按300μl/孔往微孔中加入封閉液(Na₂HPO₄ 1.44g/L、KH₂PO₄ 0.24g/L、NaCl 8g/L、KCl 0.2g/L、BSA 10g/L、sucrose 25g/L、proclin300 0.3ml/L，37℃放置1～2h進行封閉；在干燥房(18-26℃)抽干后，真空密封(2-8℃)，得到包被HPV16型E7抗體的微孔板，干燥保存；

2)、標準品、質控品

HPV16型E7蛋白校準品0、1、2、3、4、5：校準品為凍干粉，分別加入1ml ddH₂O溶解，校準品溶液的線性濃度分別為0、10、20、40、80、160ng/ml；

HPV16型E7蛋白質控品1、2：質控品為凍干粉，加入1ml ddH₂O溶解，濃度分別為10和80ng/ml；

3)、HRP標記的HPV16型E7抗體

采用過碘酸鈉法進行標記，之后加入HRP穩定劑，混勻，濃度為0.05～0.4μg/ml，2-8℃保存。

4)、人體宮頸脫落細胞裂解液

用10mM～1M緩沖液配置0.05％～1％(體積百分比)表面活性劑；用之前加入終濃度為1mM～10mM蛋白酶抑制劑；

所述的表面活性劑為Tween 20，Triton-100或十二烷基磺酸鈉中的一種或兩種以上。所述的緩沖液為phosphate-buffered saline，Tris-HCL或碳酸鹽溶液，所述的蛋白酶抑制劑為cystatin，PMSF或Antipain中的一種或兩種以上；

5)、濃縮洗滌液(20×)28.8g Na₂HPO₄·12H2O、4.8g KH₂PO₄、160g NaCl、4g KCl、10ml Tween-20、6ml proclin300加入ddH₂O，定容至1000ml，混勻，室溫保存。

6)、底物溶液、封口膜，直接購買得到。