[發(fā)明專利]一種免疫缺陷小鼠模型、其制備方法及應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610103735.6
• 申請(qǐng)日: 2016-02-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107119076A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 深圳市體內(nèi)生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;A01K67/027
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司11332
• 代理人: 鞏克棟,侯瀟瀟

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種免疫缺陷小鼠模型、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

肝臟在人體發(fā)揮解毒和代謝外源化合物功能中占領(lǐng)著戰(zhàn)略性的地位。由于小鼠飼養(yǎng)成本低、繁殖速度快、實(shí)驗(yàn)周期段短、遺傳背景清晰、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)，研究人員利用小鼠構(gòu)建各種小鼠肝臟疾病模型，如肝損傷、病毒性肝炎、肝纖維化、肝癌等，進(jìn)行肝臟疾病研究。但這些模型難以彌補(bǔ)人和小鼠存在巨大種屬差異(例如，很多肝臟代謝酶具有種屬特異性，一些人肝臟病毒如HBV、HCV等無(wú)法感染小鼠肝臟細(xì)胞)在這些模型上獲得的研究成果或治療藥物無(wú)法在人體上重現(xiàn)相同效果。而利用人體肝臟細(xì)胞體外培養(yǎng)進(jìn)行研究，則局限于人體原代細(xì)胞體外存活期限、凍存技術(shù)和無(wú)法重現(xiàn)體內(nèi)器官協(xié)作。

于是，研究人員開(kāi)展了肝臟人源化小鼠研究。肝臟人源化小鼠模型，即在可誘導(dǎo)肝臟損傷的免疫缺陷小鼠體內(nèi)移植并重建人體肝臟組織或器官。肝臟人源化模型所使用的受體小鼠免疫缺陷程度越高，對(duì)異種、異體移植物的排斥則越??；且免疫細(xì)胞參與肝臟損傷引起的炎癥反應(yīng)，若免疫系統(tǒng)完善，則在誘導(dǎo)肝臟損傷而人源肝臟組織或器官未重建的同時(shí)加速肝臟衰竭，提高小鼠死亡率。此外，可控的誘導(dǎo)性小鼠肝臟細(xì)胞損傷對(duì)移植的人源肝臟細(xì)胞的生存、增殖和發(fā)育提供了足夠的空間。

現(xiàn)有技術(shù)中最優(yōu)的可誘導(dǎo)肝臟損傷的免疫缺陷小鼠：TK-NOG(Thymidine Kinase即胸苷嘧啶激酶缺陷的NOD-Scid IL2rg-/-)免疫缺陷小鼠(Masami Hasegawa et al.,2013)、uPA-SCID(urokinase-type Plasminogen Activator即尿激酶纖維蛋白融酶原激活劑缺陷的Scid)免疫缺陷小鼠(Mercer et al.,2001)、FRG(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-)和FRGN(Fah-/-Rag2-/-il2γc-/-NOD)免疫缺陷小鼠(Hisaya Azuma et al.,2007；Elizabeth M.Wilson et al.,2014)。然而，TK轉(zhuǎn)基因雄性小鼠不育，僅能通過(guò)雜合雌鼠和野生型雄鼠，無(wú)純合小鼠品系，而uPA小鼠對(duì)供體肝臟細(xì)胞的要求非常高，且uPA基因缺失可引起迅速而嚴(yán)重的肝臟損傷，具有不可控的選擇性?；贔ah基因敲除的肝臟誘導(dǎo)損傷小鼠，如FRG、FRGN，是目前應(yīng)用最廣泛、可控性最好、高移植效率的肝臟模型工具，可通過(guò)護(hù)肝藥物NTBC(2-硝基-4-三氟甲苯-1，3環(huán)己二酮)控制Fah缺失誘導(dǎo)的肝臟損傷(Grompe et al.,1995；)。

然而，F(xiàn)RG和FRGN小鼠的免疫基因缺陷背景Rag2-/-IL2rg-/-和NOD Rag2-/-IL2rg-/-并非現(xiàn)有技術(shù)中免疫程度最高的，在構(gòu)建肝臟人源化小鼠模型中，將會(huì)對(duì)外源的異種(人體)、異體細(xì)胞產(chǎn)生一定的排斥作用影響移植效率。Wei Ye et al.,Journal of Hematology&Oncology 2015報(bào)道發(fā)現(xiàn)NOD-scid IL2rg-/-小鼠的免疫缺陷程度最高，構(gòu)建人源化小鼠模型的效果最好。基于NOD-scid IL2rg-/-免疫缺陷背景的Fah敲除小鼠將是最好的肝臟疾病人源化小鼠模型工具。然而，在探索該基因型小鼠研發(fā)上，研究人員卻遇到了一系列困難。由于NOD((non-obese diabetic)小鼠基因背景復(fù)雜且自發(fā)非肥胖性糖尿病，在NOD小鼠上進(jìn)行基因敲除可能會(huì)誘發(fā)致死或糖尿病病發(fā)(Baxter AG et al.,1995；Nichols J et al.,2009；)。再則，scid(Severe Combined Immunodeficiency Disease)小鼠Prkdc基因缺陷，DNA修復(fù)能力部分缺失，影響基因敲除工具脫靶后的基因修復(fù)，提高基因敲除小鼠的死亡率，且有研究人員發(fā)現(xiàn)NOD-scid Fah-/-小鼠在NTBC(肝臟保護(hù)藥)停藥之后，肝臟迅速衰竭，小鼠死亡(Blunt,T.et al., 1996)。而NOD-scid IL2rg的基因背景缺陷程度更高于NOD和NOD-scid小鼠。

此外，目前所有的高度免疫缺陷小鼠(缺失B、T、NK等免疫細(xì)胞)，包括NOD-Scid IL2rg-/-、Rag2-/-IL2rg-/-、Rag1-/-IL2rg-/-等，在構(gòu)建腫瘤模型上都具有極高的效率，然而這些小鼠都有毛發(fā)，在利用活體成像等技術(shù)檢測(cè)帶有熒光標(biāo)記(特別是熒光蛋白)的腫瘤細(xì)胞體內(nèi)生長(zhǎng)和分布時(shí)，毛發(fā)對(duì)于檢測(cè)結(jié)果都具有嚴(yán)重的干擾。

發(fā)明內(nèi)容