[發明專利]一種鯊魚魚肉高F值寡肽的制備方法

在審

• 申請號: 201610098095.4
• 申請日: 2016-02-23
• 公開（公告）號: CN105648009A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 王斌;趙玉勤;孫坤來
• 申請（專利權）人: 浙江海洋學院
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/16
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.一種鯊魚魚肉高F值寡肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1）鯊魚魚肉醇溶蛋白的制備：取鯊魚魚肉按1g:15mL～1g:20mL固液比加入90%～95%的乙醇溶液，用高速組織搗碎機將其制成勻漿，在25～30℃、功率650～700W超聲提取150min~180min；將提取液的pH值用1mol/LNaOH調至9.5～10.0，用蒸餾水將乙醇濃度調至55%～65%，室溫靜置45min～60min，于8000～10000rpm離心10min～15min；取上清液，并加入NaCl至濃度為5%～8%，靜置8h～10h后，于8000～10000rpm離心10～15min，收集沉淀，凍干，即得鯊魚魚肉醇溶蛋白；

2）鯊魚魚肉醇溶蛋白的酶解：取鯊魚魚肉醇溶蛋白，按固液比1g:5mL～1g:10mL，加入甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液，用0.1mol/LHCl或0.1mol/LNaOH調節pH到9.0～1.0，得混合液；將混合物溫度調制55～65℃，按照醇溶蛋白質量的0.5%～1.0%加入堿性蛋白酶，酶解時間3h～4h后，酶解液于90～95℃保溫10～15min，滅酶活；將酶解液溫度調至50～60℃，按照醇溶蛋白質量的0.6%～0.8%加入木瓜蛋白酶，酶解時間4h～5h，酶解液降至室溫，于8000～10000rpm離心10～15min，取上清液；

3）鯊魚魚肉高F值寡肽的酶解：將上述上清液依次經超濾、活性碳吸附純化和大孔樹脂精制，得鯊魚魚肉高F值寡肽；

其中，所述步驟2）中的甘氨酸—氫氧化鈉緩沖液含0.05mol/L，pH值為9.5；堿性蛋白酶酶活力為1.95×10⁵。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟1）中的鯊魚優選為灰星鯊（Mustelusgriseus）。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所述步驟3）的超濾、活性碳吸附純化和大孔樹脂精制的具體過程為：

超濾：將上述酶解上清液于0.1～0.15MPa的工作壓力和20～30℃的工作溫度下采用采用3kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3kDa部分，得超濾酶解液；

活性碳吸附純化制：將超濾酶解液調pH值至2.5~3.5，按照物料與活性炭顆粒比為10～15:1將超濾酶解液以0.3～0.5mL/min流速緩慢加入到活性炭顆粒裝載于玻璃柱中，上樣完成后，采用2～3柱體積的1：1比例的1mol/L氨水和無水乙醇混合溶液洗脫色譜柱，收集洗脫液，干燥，得活性肽精制多肽

大孔樹脂精制：將活性碳精制多肽配成10～20mg/mL的溶液，調pH值至6.5～7.5，緩慢加入到物料與AB-8大孔樹脂比為10～15:1的玻璃柱中，用2～3倍柱體積的雙蒸水洗脫除去雜質，再用2～3柱體積的95%乙醇洗脫，收集95%乙醇洗脫物，噴霧干燥，即為鯊魚魚肉高F值寡肽。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于所制備的高F值寡肽的蛋白含量為95.1～96.4%，氨基酸總量為83.7～85.4%，支鏈氨基酸的含量為16.8～17.1%，芳香族氨基酸的含量為0.43～0.48%，F值為35.2～39.6，分子量為630～720Da，支鏈氨基酸中Val：Ile：Leu為1：1～1.5：3～4，芳香族氨基酸中Trp：Tyr：Phe為1：1～1.2：1～1.5。