[發(fā)明專利]基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610097415.4
• 申請日: 2016-02-23
• 公開（公告）號: CN105671030A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王劍青
• 申請（專利權(quán)）人: 蘇州摩根基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘇州中合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32266
• 代理人: 馬麗麗

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

血漿是血液除去血細胞和血小板外的液體組分，約占全血體積的50-60％。通過抗凝采血管采集血液，離心后收集到的上層淡黃色液體即為血漿。研究表明，在血漿中除了水分、血漿蛋白、氨基酸、糖類和無機鹽等化學(xué)成分外，還存在游離于細胞之外的脫氧核糖核酸分子，稱為血漿細胞游離DNA。近年來，血漿細胞游離DNA在醫(yī)學(xué)診斷中的應(yīng)用不斷拓展，其廣泛應(yīng)用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查、腫瘤液體活檢和腫瘤個體化用藥指導(dǎo)等領(lǐng)域。

提取高質(zhì)量的血漿細胞游離DNA是對其進行深入研究和進行醫(yī)學(xué)診斷的基本前提。血漿細胞游離DNA由于其片段短(幾十到幾百bp不等)、豐度低(正常人體血漿中每毫升含量為幾納克至幾十納克)的特點，其提取難度大于體細胞的基因組DNA。在實際應(yīng)用中，為了避免DNA片段信息的丟失，對于血漿細胞游離DNA的提取有著高效提取、避免損失的要求。目前用于提取血漿細胞游離DNA的方法主要有離心柱法和磁珠法兩大類，但是在實際應(yīng)用中均存在提取效率偏低、部分DNA片段易丟失、批次操作效果不均一的問題，這對于血漿細胞游離DNA的研究應(yīng)用造成了不利影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明公開了一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA的提取方法，該方法能高效、快速地獲得高質(zhì)量的細胞游離DNA，可以滿足PCR擴增、定量和定性分析、測序等分子生物學(xué)實驗的要求。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種基于磁珠法的高效血漿細胞游離DNA提取方法，具體包括如下步驟：

(1)預(yù)處理，取血漿樣品置于離心管中，加入預(yù)處理液P，在50-60℃水浴中保存0.5-1h，預(yù)處理液P：0.5-3％(w/v)蛋白酶K，1-3mM氯化鈣。由于血漿細胞游離DNA能與蛋白形成復(fù)合物，因此通過預(yù)處理降解血漿蛋白，有助于提高血漿細胞游離DNA的捕獲效率和實驗結(jié)果一致性。

(2)配置結(jié)合液B，在兩步溫控條件下采用羥基磁珠特異性吸附樣品中的DNA，具體地，向經(jīng)過預(yù)處理的樣品中加入結(jié)合液B；漩渦振蕩15-30s；在50-60℃水浴中反應(yīng)3-5min；從水浴中取出離心管，漩渦振蕩15-30s；使用旋轉(zhuǎn)混合儀，在室溫條件下反應(yīng)5-10min；計時結(jié)束后，在3000-4000g條件下離心30-60s，將離心管放在磁力架上，靜置1-2min進行磁珠分離，計時結(jié)束后用移液器除去上清，保留磁珠。上述用到的結(jié)合液B：92-98％(v/v)異丙醇，1-3％(v/v)非極性溶劑，1-5％(v/v)磁珠懸浮液，其中，磁珠懸浮液為20％(w/v)納米磁珠，非極性溶劑為石油醚、正己烷、四氯化碳、苯中的一種或多種混合，添加非極性溶劑的目的是增加溶液環(huán)境的非極性，促進核酸分子被納米磁珠吸附。

(3)洗滌，配置洗滌液W1和W2對吸附有DNA的磁珠進行清洗，具體地，首先鹽洗滌去除雜質(zhì)，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的離心管中加入洗滌液W1，漩渦振蕩2-3min；靜置1-2min后在3000-4000g條件下離心30-60s，將離心管放在磁力架上，靜置1-2min進行磁珠分離，計時結(jié)束后用移液器除去上清，保留磁珠；然后進行醇洗滌去除鹽分，向完成吸附、去除上清、留有磁珠的離心管中加入洗滌液W2，漩渦振蕩2-3min；靜置1-2min后在3000-4000g條件下離心30-60s，將離心管放在磁力架上，靜置1-2min進行磁珠分離，計時結(jié)束后用移液器除去上清，保留磁珠，敞開管口室溫放置10min以便乙醇揮發(fā)，洗滌液W1：5-20mM三羥甲基氨基甲烷，1-5mM乙二胺四乙酸，60-75％(v/v)乙醇；洗滌液W2：70-80％(v/v)乙醇。