[發明專利]結核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201610096261.7
• 申請日: 2016-02-22
• 公開（公告）號: CN105601753A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 付玉榮;伊正君
• 申請（專利權）人: 濰坊醫學院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/16;A61P31/06
• 代理公司: 濰坊正信專利事務所 37216
• 代理人: 石譽虎

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種結核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋 白及其制備方法和應用。

背景技術

大量結核感染病例的存在和常規藥物對結核感染進行治療面臨著很大困境。尤其 是耐藥結核分枝桿菌特別是多重耐藥菌的出現對人類健康構成了極大威脅，這類耐藥細菌 導致的結核面臨無藥可用的境地，已成為結核病防治的巨大障礙。如何有效地根治結核感 染特別是耐藥結核感染已經成為當前許多國家結核病防治工作面對的難題。尋找新的有效 的抗結核分枝桿菌制劑已經成為刻不容緩的問題。

噬菌體制劑作為新型的治療方法，受到越來越廣泛的關注。噬菌體具有高度專一 的宿主選擇性，噬菌體殺滅宿主菌具有高度特異性，不會影響其他菌群，不會破壞體內微生 態的平衡，也不引起胃腸道反應、過敏反應等。實驗證明噬菌體治療細菌感染具有很高的有 效性和安全性。噬菌體治療細菌感染具有許多優勢，尤其是耐藥菌的感染。例如耐甲氧西林 的金黃色葡萄球菌(MRSA)的治療是臨床上面臨的棘手的問題，Capparelli等人利用噬菌體 來控制MRSA的感染，取得了良好的效果，研究結果顯示MRSA噬菌體在體內和體外都可以殺 滅巨噬細胞內部的MRSA。

目前噬菌體全菌治療體內細菌感染遇到的最大瓶頸，一是較難實現體內靶向性給 藥；二是機體免疫系統對噬菌體的清除也是噬菌體治療中必須解決的一個重要問題。此外 機體免疫系統產生針對噬菌體的中和抗體，引起噬菌體失活，為了避免出現這一情況，需要 找到降低噬菌體免疫原性的方法。

噬菌體對宿主菌的溶解是由噬菌體自身溶菌蛋白介導的溶解系統完成的。溶菌蛋 白是一類細胞壁裂解酶類，它與細菌細胞壁的糖基特異性結合，發揮作用；而這種細胞壁糖 基具有種屬特異性。為了克服活性噬菌體制劑的局限性，人們探索了提純噬菌體的特異性 溶菌蛋白作為抗菌制劑治療細菌感染。例如研究表明，純化的噬菌體溶菌蛋白Cpl-1在肺炎 鏈球菌引起的心內膜炎和細菌性腦膜炎的試驗中，顯示出了良好的抗菌活性。噬菌體編碼 的溶菌蛋白不僅能高效的殺滅耐藥葡萄球菌屬細菌引起的感染菌而且在體內無殘留。

發明內容

本發明所要解決的第一個技術問題是：針對現有技術存在的較難實現體內靶向性 給藥和產生噬菌體免疫原性最終會導致噬菌體失活的不足，提供一種具有靶向殺滅結核分 枝桿菌的來源于噬菌體的融合雙組份溶菌蛋白。

本發明所要解決的第二個技術問題是：提供一種結核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌 蛋白的制備方法。

本發明所要解決的第三個技術問題是：提供一種結核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌 蛋白在制備治療結核分枝桿菌感染的藥物中的用途。

為解決上述第一個技術問題，本發明的技術方案是：將兩段編碼噬菌體溶菌蛋白 的基因序列在噬菌體溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物作用下經過擴增、連接、構建載體、轉 化、表達、純化后制得結核桿菌噬菌體雙組份融合溶菌蛋白。所述噬菌體溶菌蛋白1引物為 包含以下序列的引物：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

所述噬菌體溶菌蛋白2引物為包含以下序列的引物：

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：

5’-GAAGCGGCCGCTCTAGATCAGATCTGTCGTAGGAACTCG-3’

優選的，所述噬菌體溶菌蛋白1和溶菌蛋白2的引物為：

溶菌蛋白1LB上游：

5’-CATCCATGGGCAAGCTTATGAGCCCCAAGATCCG-3’

溶菌蛋白1LB下游：

5’-GTAGCGGCCGCTCTAGATCATCGGTTCCAGGGCT-3’

溶菌蛋白2HN上游：

5’-CTACCATGGGCAAGCTTATGAGCAAGCCCTGGCT-3’

溶菌蛋白2HN下游：