[發明專利]一種有效擴增CIK且提高其特異性殺瘤能力的方法

有效

• 申請號: 201610082971.4
• 申請日: 2016-02-06
• 公開（公告）號: CN105505871B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 肖桂清;蘇愛盟
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

本發明提供了一種擴增CIK細胞且提高其特異性殺瘤的培養方法，所述的方法包括分離獲得單個核細胞，將其轉至培養瓶中，加入終濃度為400?600ng/ml CD3mAb、1400?1600 ng/ml CD28mAb、4000?4800IU/ml IFN?γ、4000?4800IU/ml IL?2、140?160ng/ml IL?15，第4天補加600?1000IU/ml IL?2、20?30ng/ml IL?15的新鮮培養液，第6天分瓶培養，第8、9天分別將瓶中的細胞轉至1.8L細胞培養袋內，補加600?1000IU/ml IL?2、20?30ng/ml IL?15的新鮮培養液，第11天將細胞分袋培養補加600?1000IU/ml IL?2、20?30ng/ml IL?15的新鮮培養液，繼續誘導擴增，第15?21天內收獲細胞；將收獲的細胞用抗EGFR×抗CD3雙功能抗體常溫下孵育30?40分鐘后，用生理鹽水洗滌后收集細胞，即制成特異性殺瘤的CIK細胞制劑。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種有效擴增CIK細胞且提高其特異性殺瘤的方法。

背景技術

惡性腫瘤是繼心血管疾病之后的危害人類健康的第二號殺手，近年來，腫瘤的發生率和死亡率呈逐年上升的趨勢，且腫瘤發病成年輕化趨勢。隨著分子生物學和免疫學等學科的快速發展，腫瘤的生物免疫治療已成為繼手術、放療、化療之后的第四種療法。其中，腫瘤過繼性免疫細胞治療成為當前研究的熱點，其是指將人體外擴增的具有抗腫瘤活性的免疫細胞回輸至患者體內，從而直接或間接激發機體免疫應答以殺傷腫瘤細胞的一種細胞療法。它具有個體性、安全性、靶向性和高效性等優勢。

細胞因子誘導的殺傷性細胞(Cytokine-Induced Killer cells，CIK)屬于腫瘤過繼性免疫細胞治療中的一種，由美國斯坦福大學的Schmidt Wolf于1991 年首次報道，他們發現人外周血單個核細胞于多種細胞因子(如IFN-γ、抗CD3McAb、IL-1α和IL-2) 作用一段時間后，被定向誘導并大量增殖成為可同時表達CD3 和CD56 兩種膜蛋白分子, 且兼具有T淋巴細胞強大的抗瘤活性和NK細胞的非MHC 限制性殺瘤優點的異質細胞群。CIK 細胞具有體外增殖速度快、殺瘤活性高、殺瘤譜廣、不良反應少、對多重耐藥腫瘤細胞同樣敏感、可提高患者免疫功能等特點，是臨床應用中的一類較為理想的效應細胞，被認為是腫瘤過繼免疫治療的希望。

然而，此類效應細胞在人正常外周血中數量極少，僅占1％～5％。目前，人們雖能通過常規的CIK 制備方法獲得一定數量的CIK細胞，但獲得的CIK 細胞的細胞毒性和增殖倍數均不夠理想。由此可見，如何獲得數量足夠、細胞毒性強的效應細胞是保證治療效果的必備條件。此外，CIK細胞的一個特點是殺瘤譜廣，意味著它的特異性殺瘤能力較差，就某種特定的腫瘤而言，如表皮生長因子受體（EGFR）陽性腫瘤，如何提高其特異性殺傷EGFR陽性腫瘤細胞的能力是提升CIK細胞治療效果所不得不考慮的又一個現實問題。EGFR對腫瘤的生長、發展及腫瘤干細胞的維持都有著非常重要的作用，且在多種實體瘤中存在過表達或異常表達，因此在本專利研究中可作為一個重要的靶標。

發明內容

本發明的目的在于提供一種有效擴增CIK且提高其特異性殺瘤能力的方法，解決了目前獲得的CIK 細胞的增殖倍數不夠理想；CIK誘導過程中需持續補充各種細胞因子，較為繁瑣；CIK細胞廣譜殺瘤的特點所導致其特異性殺瘤能力弱等缺點。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

用Ficoll 淋巴細胞分離液分離獲得單個核細胞，將其轉至T175培養瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第4天補加IL-2和IL-15，第6天分瓶培養，第8、9天分別將瓶中的細胞轉至1.8L細胞培養袋內，補加IL-2和IL-15，第11天將細胞分袋培養，補加IL-2和IL-15，繼續誘導擴增，第15-21天內收獲細胞。將收獲的細胞用一種抗EGFR×抗CD3雙功能抗體常溫下孵育30-40分鐘后，用生理鹽水洗滌后收集細胞，即可制成特異性殺傷EGFR陽性腫瘤細胞的CIK細胞制劑。