[發明專利]一種有效擴增CIK且提高其特異性殺瘤能力的方法

有效

• 申請號: 201610082971.4
• 申請日: 2016-02-06
• 公開（公告）號: CN105505871B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發明（設計）人: 肖桂清;蘇愛盟
• 申請（專利權）人: 福建省銀豐干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一種擴增CIK細胞且提高其特異性殺瘤的培養方法，其特征在于：所述的方法包括分離獲得單個核細胞，將其轉至培養瓶中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ、IL-2、IL-15，第3、4天分別補加IL-2和IL-15，第6天分瓶培養并補加IL-2和IL-15，第8、9天分別將瓶中的細胞轉至1.8L細胞培養袋內，各自補加IL-2和IL-15，第11天將細胞分袋培養補加IL-2和IL-15，繼續誘導擴增，第15-21天內收獲細胞；將收獲的細胞用抗EGFR×抗CD3雙特異性抗體常溫下孵育30-40分鐘后，用生理鹽水洗滌后收集細胞，即制成特異性殺瘤的CIK細胞制劑。

2.根據權利要求1所述的一種擴增CIK細胞且提高其特異性殺瘤的培養方法，其特征在于：所述方法具體包括如下：

（1）單核細胞分離：

（a）取500ul 外周血用血細胞分析儀計數、活性檢測：將外周血與生理鹽水等體積混合，之后加入40ml Ficoll 淋巴細胞分離液離心分離單核細胞；離心參數：1600rpm、20 攝氏度、20 分鐘；

（b）取白膜，加入生理鹽水至總體積80ml，離心洗滌兩次；離心參數：2000rpm、20攝氏度、8分鐘；

（c）細胞用無血清基礎培養基重懸細胞沉淀，利用細胞計數儀進行細胞計數；

（2）CIK 誘導培養：

（a）分離的單核細胞計數后，按8-10×10⁵個/ml 密度接種于培養瓶中，補加終濃度為400-600ng/ml CD3mAb、1400-1600 ng/ml CD28mAb、4000-4800IU/ml IFN-γ、4000-4800IU/ml IL-2、140-160ng/ml IL-15，補充無血清培養基至50ml；

（b）第3天，細胞計數，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液50ml；

（c）第4天，細胞計數，加入600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液50ml；

（d）第6天分瓶培養，細胞計數，將原培養瓶中的細胞懸液混勻后按體積比1.4:1分別轉移至兩新T175培養瓶中，分別標記為a.b和c.d，兩瓶分別補加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液至240ml；

（e）第8天裝袋培養，細胞計數，將a.b培養瓶中細胞懸液裝入1.8L細胞培養袋-袋a中，補加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液至終體積1000ml；

（f）第9天裝袋培養，細胞計數，將c.d培養瓶中細胞懸液裝入1.8L細胞培養袋-袋c中，補加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液至終體積1000ml；

（g）第11天分袋培養，細胞計數后，將原培養袋-袋a和袋c中的細胞懸液分別按1.4:1比例分至兩新培養袋-袋b和袋d中，四個細胞培養袋分別補加600-1000IU/ml IL-2、20-30ng/ml IL-15的新鮮培養液至終體積1000ml；

（h）第15、17、19、21天，細胞計數，收獲袋a、袋b、袋c、袋d細胞，所收獲的細胞分別用抗EGFR×抗CD3雙特異性抗體在常溫下孵育30-40分鐘后，用生理鹽水洗滌后收集細胞，即制成特異性殺瘤的CIK細胞制劑。