[發明專利]一種凝集素蛋白寡聚復合體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201610082115.9
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN105622761B
• 公開（公告）日: 2019-10-25
• 發明（設計）人: 約瑟夫·弗戈邁;劉麗;段旭初
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K14/405;C12N15/63;C12N15/62;C12N1/21;A61K38/16;A61P31/12
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;李曉峰

本發明屬于生物工程領域，公開了一種凝集素蛋白寡聚復合體的構建方法及其應用，將至少兩個凝集素蛋白單體的核酸序列克隆并串聯連接至蛋白表達載體的多克隆位點中構建凝集素蛋白寡聚復合體的重組表達載體，由所述重組表達載體進行表達獲得凝集素蛋白寡聚復合體。本發明核心內容是將凝集素蛋白單體通過分子生物學和基因工程技術改造成為凝集素蛋白寡聚復合體。本發明通過凝血實驗效果檢測證明：所述凝集素蛋白寡聚復合體和原單體蛋白相比具有顯著增強的凝血活性，且其效果隨復合體中單體數目的增加而增加，表明所述各凝集素蛋白寡聚復合體具有更強的結合糖鏈的能力。本發明利用基因工程手段克隆構建并表達了凝集素蛋白寡聚復合體，實現了各凝集素蛋白寡聚復合體的大量重組表達。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，涉及一種凝集素蛋白寡聚復合體的構建方法及其應用。

背景技術

凝集素是生物體中能夠與糖鏈物質特異性識別并結合的一類蛋白質分子。在生物體中，凝集素的功能涉及細胞與細胞間的識別與交流，細胞信號的傳導，病原體的侵染及其與宿主間的相互作用，疾病的發生及免疫系統的調節等方面。凝集素在醫學上被廣泛用于抗病毒藥物的研發，在農業生產領域，也可被用作抵抗病蟲害的生物制劑等。

在病毒侵染宿主過程中，病毒糖蛋白與宿主細胞受體蛋白間的識別與互作是介導病毒進入宿主細胞的第一步。研究表明，一些凝集素分子能夠競爭性結合病毒表面的糖蛋白，而減少和抑制其與宿主細胞表面受體蛋白間的結合，從而阻止病毒侵染宿主細胞。凝集素與病毒糖蛋白間的結合效力越強，對病毒侵染宿主細胞的抑制能力也就越強，而凝集素與糖蛋白間的結合效力與凝集素分子上具有的糖鏈結合位點數相關，即糖鏈結合位點數越多，其結合糖蛋白的能力也越強。

此前已有研究發現來自于Microcystis aeruginosa的凝集素microvirin(MVN)具有較強的抵抗艾滋病病毒(HIV)侵染的能力，MVN可以特異性的結合含甘露糖結構的糖鏈，且該凝集素單體蛋白上僅有一個糖鏈結合位點，因此，如果構建具有多個MVN單體的凝集素寡聚復合體蛋白，將會使其分子具有更多的糖鏈結合位點，從而增強其結合病毒和阻抑病毒侵染宿主細胞的能力。

發明內容

本發明的目的是應用分子生物學與基因工程技術，提供一種新的凝集素蛋白寡聚復合體的構建方法。

本發明的另一目的是提供上述方法構建的凝集素蛋白寡聚復合體。

本發明的又一目的是利用上述凝集素蛋白寡聚復合體構建方法構建的凝集素蛋白寡聚復合體在實際中的應用。

本發明的目的可通過如下技術方案來實現：

一種凝集素蛋白寡聚復合體的構建方法，將至少兩個凝集素蛋白單體的核酸序列克隆并串聯連接至蛋白表達載體的多克隆位點中構建凝集素蛋白寡聚復合體的重組表達載體，由所述重組表達載體進行表達獲得凝集素蛋白寡聚復合體。上述的凝集素為包含MVN在內的所有類型的凝集素。本發明所述的構建方法適用于所有凝集素的蛋白寡聚復合體的構建，并不僅限于MVN。

優選的，所述的凝集素蛋白寡聚復合體為凝集素蛋白單體按串聯順序排列的凝集素蛋白二聚體、凝集素蛋白三聚體、凝集素蛋白四聚體及四個以上凝集素蛋白單體組成的復合體，且各凝集素蛋白單體之間具有間隔序列。

所述凝集素蛋白二聚體的重組表達載體為將兩個凝集素蛋白單體的核酸序列插入到蛋白表達載體的NdeI、BamHI和XhoI三個酶切位點之間，所述凝集素蛋白三聚體的重組表達載體為將三個凝集素蛋白單體的核酸序列插入到蛋白表達載體的NdeI、BamHI、EcorI和XhoI四個酶切位點之間，所述凝集素蛋白四聚體的重組表達載體為將四個凝集素蛋白單體的核酸序列插入到蛋白表達載體的NdeI、BamHI、EcorI、SacI和XhoI五個酶切位點之間。