[發(fā)明專利]一種四價(jià)流腦-Hib聯(lián)合疫苗的制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610077652.4
• 申請(qǐng)日: 2016-02-03
• 公開（公告）號(hào): CN105641690A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯文禮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/116
• 分類號(hào): A61K39/116;A61K39/095;A61K39/102;A61K39/385;A61P31/04
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種四價(jià)流腦-Hib聯(lián)合疫苗的制備 方法。

背景技術(shù)

流行性腦脊髓膜炎，是由腦膜炎雙球菌感染腦膜或者腦脊髓膜引起的呼 吸道傳染病，臨床表現(xiàn)主要有高燒、頭痛、噴射狀嘔吐、脖子發(fā)硬。也可引 起敗血癥，皮膚出現(xiàn)紫色淤血、瘀斑，腦膜炎會(huì)引起腦部損傷而遺留聽力下 降或耳聾、智力低下等后遺癥。病死率在5％～10％。流腦冬春季節(jié)病例高 發(fā)，一般11～12月份病例開始增多，第二年的2～5月份為發(fā)病高峰期。該 病是發(fā)病率高，危險(xiǎn)性大，是嚴(yán)重危害兒童健康的傳染病。根據(jù)莢膜多糖的 化學(xué)結(jié)構(gòu)，腦膜炎球菌可分為十幾個(gè)血清群，其中A、B、C、Y和W135 是最主要的流行菌群。接種疫苗是預(yù)防流腦的主要途徑。

用腦膜炎球菌莢膜多糖制備的疫苗具有一定的預(yù)防效果，但它是一種T 細(xì)胞非依賴性抗原，對(duì)2歲以下的嬰幼兒免疫效果很差，而且不能誘生免疫 記憶。與載體蛋白偶聯(lián)可以將多糖抗原轉(zhuǎn)變?yōu)門細(xì)胞依賴性抗原，不但對(duì) 嬰幼兒有效，而且能誘生免疫記憶。但是這種多糖蛋白結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝 比較復(fù)雜，產(chǎn)量較低，價(jià)格較貴，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足計(jì)劃免疫的大規(guī)模需求。因 此，有必要研制一種新型的腦膜炎球菌疫苗。

流感嗜血桿菌分類為兩類，即莢膜菌株及沒有莢膜的菌株。雖然已知莢 膜類的乙型流感嗜血桿菌(或是b型流感嗜血桿菌，簡(jiǎn)稱Hib)是毒性的主 因之一，但感染流感嗜血桿菌的病因卻仍未完全清楚。Hib是主要通過腦膜 炎和肺炎每年估計(jì)造成約300萬(wàn)人嚴(yán)重患病并估計(jì)造成38.6萬(wàn)人死亡的一 種細(xì)菌。幾乎所有患者都是5歲以下兒童，年齡為4至18個(gè)月的兒童尤為 脆弱。它們的莢膜能幫助它們抵抗在沒有免疫的寄主體內(nèi)的吞噬作用及不觸 發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解。沒有莢膜的菌株則較少侵略性，但它們能誘發(fā)炎癥而產(chǎn) 生其他病癥，如會(huì)厭炎。接種Hib結(jié)合型疫苗是一種有效的預(yù)防方法，其中 某幾種疫苗已經(jīng)廣為使用。

絕大多數(shù)Hib死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家。在這些國(guó)家，肺炎比腦膜炎 造成更多的死亡。但是，Hib腦膜炎在這些國(guó)家也是一個(gè)嚴(yán)重問題，與發(fā)達(dá) 國(guó)家相比死亡率高許多倍；該病使15％至35％的存活者患有終身殘疾，例 如精神發(fā)育遲滯或耳聾。與流感嗜血桿菌的名稱暗示的相反，這種細(xì)菌不會(huì) 引起流感。

Hib通常見于生活在不進(jìn)行疫苗接種區(qū)域的健康人鼻喉中。到5歲時(shí)， 幾乎所有未接種疫苗的兒童都與Hib有接觸。細(xì)菌通過呼出的飛沫傳播。有 時(shí)候，Hib可侵入血流并在人體的其它部位引起感染和疾病，這些部位包括 腦脊髓膜(大腦和脊髓的包膜)–導(dǎo)致腦膜炎，以及肺–造成肺炎。

由于ACYW135群腦膜炎球菌疫苗抗原和b型流感嗜血桿菌多糖結(jié)合疫 苗抗原都為多糖，前兩針接種時(shí)間均為4-6個(gè)月，可制成四價(jià)流腦-Hib聯(lián)合 疫苗，減少接種次數(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種四價(jià)流腦-Hib聯(lián)合疫苗的制備方法。

為達(dá)上述目的，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中提供了一種四價(jià)流腦-Hib聯(lián)合疫苗 的制備方法，包括以下步驟：

(1)發(fā)酵培養(yǎng)：將A群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、C群腦膜炎奈瑟氏球菌菌 種、Y群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種、W135群腦膜炎奈瑟氏球菌菌種和B型流感嗜 血桿菌分別接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵，并于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的后期或靜止期的前期終止培 養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液；

(2)滅菌沉淀：將培養(yǎng)液滅菌后高速離心，收集上清液，并在上清液中加 入十六烷基三甲基溴化銨充分混勻，然后靜置再離心，收集沉淀物；

(3)解離：在腦膜炎球菌的沉淀物中加入氯化鈣溶液研磨均勻，并將混合 液攪拌解離十六烷基三甲基溴化銨；在B型流感嗜血桿菌沉淀物中加入氯化鈉 溶液中解離，解離后離心收集上清液；分別得到腦膜炎球菌多糖復(fù)合物和B型 流感多糖復(fù)合物；

(4)去核酸：腦膜炎球菌多糖復(fù)合物中加入2℃～8℃的95％乙醇溶液混勻， 靜置后離心去沉淀，收集上清液，得到腦膜炎去核酸多糖復(fù)合物；

B型流感嗜血桿菌多糖復(fù)合物微孔過濾后進(jìn)行超濾濃縮，并使用PBS溶液 反復(fù)清洗濃縮液，收集濃縮洗滌液，并加入乙醇溶液在低溫條件下靜置；再離 心去除沉淀；上清液再加入無(wú)水乙醇靜置，并再次離心分別收集沉淀和上清液， 沉淀用水溶解后離心去除不溶物；上清液使用23～25KD的透析袋透析，得到B 型流感去核酸多糖復(fù)合物；