[發明專利]檢測脫氧核糖核酸酶的DNA探針、試劑盒和方法

在審

• 申請號: 201610076852.8
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105648062A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發明（設計）人: 張必良;劉靄珊;曹亮;克雷格·梅洛
• 申請（專利權）人: 廣州市銳博生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/34;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香;胡杰

技術領域

本發明涉及酶檢測領域，具體而言，涉及脫氧核糖核酸酶的檢測方法及一 種脫氧核糖核酸酶檢測DNA探針和試劑盒。

背景技術

脫氧核糖核酸酶(DNase酶)普遍存在于細胞中，參與了多種生理生化過程， 例如DNA復制和修復、細胞凋亡等。其也可用作疾病的標志物，如在關節炎、 腎炎患者體內，其DNA酶I表達水平低[Nadano,D.；Yasuda,T.；Kishi,K. MeasurementofdeoxyribonucleaseIactivityinhumantissuesandbodyfluidsbya singleradialenzyme-diffusionmethod.Clin.Chem.1993,39,448–452.]；DNase酶也 可用于疾病的治療，如DNaseI可用于治療囊性纖維瘤。

傳統的DNase檢測方法包括高效液相色譜(HPLC)或酶聯免疫吸附試驗 (ELISA)等。然而，這些方法普遍存在靈敏度不高，檢測耗時，對儀器設備要 求高等缺點。為解決上述問題，比色法、電化學方法等技術被開發出來。比色 法是基于DNaseI裂解底物產生的短DNA片段可被凝膠電泳或分光光度法檢 測，該法雖然操作簡單、成本低，但靈敏度較低；在電化學方法中，二茂鐵基 寡核苷酸被用于DNA酶檢測；二茂鐵是電化學活性的信號分子(Hillier,S.C.； Frost,C.G.；Jenkins,A.T.；Braven,H.T.；Keay,R.W.；Flower,S.E.；Clarkson,J.M.An electrochemicalstudyofenzymaticoligonucleotidedigestion.Bioelectrochem2004, 63,307–310.)，DNA酶I使二茂鐵從電極釋放，電流下降，從而可利用伏安法檢 測DNA酶I活性。該法雖能達到較低的檢測限，但其結果受電極修飾、操作環境 等影響大，難以作為一種常規的檢測技術。

在大量的研究和生產中，需要穩定的DNA分子，即DNA分子需處于無DNase 酶或對DNase酶含量有一定限制的環境中，因此，對脫氧核糖核酸酶殘留與否的 檢測就非常重要，特別是急需一種簡便、高靈敏、高通量的常規DNase含量檢測 方法，該檢測方法可廣泛用于檢測生物制品(如BSA)、試劑、表面環境(如 實驗臺，容器、儀器表面等)中的DNase酶等，確保研究的準確性和生產的穩定 性。

發明內容

本發明的目的之一在于建立一種高靈敏度、高通量、簡便常規的脫氧核糖 核酸酶檢測方法，能準確地檢測不同樣本中不同脫氧核糖核酸酶的活性及含量。

本發明的另一目的在于提供一種包含莖環結構的DNA探針，該探針可用于 脫氧核糖核酸酶定量檢測。

本發明的另一目的在于提供脫氧核糖核酸酶檢測試劑盒。

實現上述目的的技術方案如下。

一種DNA探針，其包含有一個莖環結構，且2個末端或內部分別連接有能 量供體基團和能量受體基團，能量供體基團和能量受體基團之間能進行能量轉 移,所述DNA探針的堿基長度為15-50個核苷酸，且包含一個能被DNase切割 的位點，被降解后的探針的能量供體基團和能量受體基團在不同的探針片段上；

所述莖環結構中，其莖結構包括位于探針兩端的5～15bp的回文互補序列， 其環結構包括長度為5-20nt的核苷酸序列，探針退火后形成發夾結構，兩個回 文互補部分Tm值大于35℃。

優選莖區至少包括1個T，2個T，3個T，4個T，5個T，6個T；和/ 或環區至少包括1個A、1個C、1個T和1個G。

在其中一個實施例中，所述DNA探針至少包括一個具脫氧核糖核酸酶抗性 和/或提高酶解特異性的修飾的核糖核苷酸。能防止DNA探針被酶降解的核苷酸 修飾方式都可以，能提高探針和酶反應的特異性修飾方式都適用本發明，優選 核糖2-位修飾、磷酸骨架修飾。所述磷酸骨架修飾具體為硫代磷酸酯修飾、二硫 代磷酸酯修飾、磷酸三酯修飾等。所述核糖修飾具體為2'-O-甲基核糖核苷酸、2’-F 核糖核苷酸、2'-甲氧基乙氧基核糖核苷酸、2’-脫氧核糖核苷酸、2'-O-烯丙基核 糖核苷酸、2'-O-戊基核糖核苷酸或2'-O-丁基核糖核苷酸，更優選為：所述DNA 探針的末端的核糖核苷酸為硫代磷酸核糖核苷酸。