[發(fā)明專(zhuān)利]一種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法及聯(lián)合疫苗

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610076833.5
• 申請(qǐng)日: 2016-02-03
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105646726A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯文禮
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 成都康華生物制品有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C08B37/00
• 分類(lèi)號(hào): C08B37/00;C12P19/04;A61K39/116;A61K39/10;A61K39/08;A61K39/05;A61K39/102;A61P31/04;C12R1/02
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1.一種B型流感嗜血桿菌莢膜多糖的制備方法，包括以下步驟：

(1)發(fā)酵培養(yǎng)：將B型流感嗜血桿菌接種到發(fā)酵罐中發(fā)酵，并于對(duì)數(shù)生長(zhǎng) 的后期或靜止期的前期終止培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)液；

(2)滅菌沉淀：將培養(yǎng)液滅菌后高速離心，收集上清液，并在上清液中加 入十六烷基三甲基溴化銨充分混勻，然后靜置再離心，收集沉淀物；

(3)多糖提取和純化

在B型流感嗜血桿菌的沉淀物中加入氯化鈉溶液中解離，解離后離心收集 上清液；上清液先進(jìn)行超濾濃縮，濃縮后加入乙醇至乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20％，低 溫靜置后離心去除沉淀，然后離心液中加入無(wú)水乙醇至乙醇含量為85％，低溫 靜置后離心，收集沉淀并使用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，然后在沉淀中加入水溶解， 溶解液再次離心，并將離心液進(jìn)行透析處理；濃縮得到粗制多糖；

將粗制多糖溶于飽和醋酸鈉溶液中，加入冷酚溶液抽提數(shù)次；然后攪拌離 心收集上清液，并通過(guò)超濾或者透析脫酚，再加入乙醇至終濃度為60％～80％， 離心后收集沉淀物，沉淀物使用無(wú)水乙醇和丙酮洗滌，然后真空干燥得到精制 多糖；

(4)多糖衍生

將精制多糖溶于蒸餾水中調(diào)節(jié)pH值至10.5～11，溫度20℃～26℃下活化， 然后加入酸液至pH為9，然后加入己二酸二酰肼ADH反應(yīng)，反應(yīng)完畢后調(diào)節(jié) pH值至弱堿性攪拌12h以上，然后透析、過(guò)濾、干燥；得到多糖衍生品；

(5)多糖蛋白結(jié)合物的制備

將多糖衍生品與載體蛋白混合后調(diào)節(jié)pH值至5.5～5.9，加入1-(3-二甲氨基 丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC于2℃～8℃反應(yīng)，反應(yīng)完畢后調(diào)節(jié)pH值至6.7～7.1 透析，透析液經(jīng)過(guò)柱層析純化、濃縮后使用超濾膜除菌，得到B型流感嗜血桿 菌莢膜多糖。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中用發(fā)酵罐培養(yǎng) 菌液，接種初濃度A600＝0.18，培養(yǎng)pH為7.5，培養(yǎng)溫度為36℃，培養(yǎng)時(shí)間為 10h～15h；收獲細(xì)菌濃度A600≥4.0。

3.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(2)中十六烷基三甲基溴 化銨的終濃度體積分?jǐn)?shù)為0.1％。

4.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(3)中氯化鈉加入后沉淀 物多糖的終濃度為10mg/ml。

5.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(3)中加入乙醇至乙醇質(zhì) 量分?jǐn)?shù)為20％，在4℃下靜置12h以上后離心去除沉淀。

6.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(4)中己二酸二酰肼ADH 的加入量為精制多糖的3倍～4倍。

7.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(4)精制多糖的含量為 10mg/10ml。

8.如權(quán)利要求1的方法，其特征在于：所述步驟(5)中載體蛋白為破傷風(fēng) 類(lèi)毒素蛋白。

9.一種含有權(quán)利要求1～8中任一所述方法制備得到的B型流感嗜血桿菌莢 膜多糖的聯(lián)合疫苗，其特征在于：所述聯(lián)合疫苗中包括B型流感嗜血桿菌莢膜 多糖、無(wú)細(xì)胞百日咳疫苗、白喉類(lèi)毒素疫苗和破傷風(fēng)類(lèi)毒素疫苗。

10.制備權(quán)利要求9所述疫苗的方法，其特征在于：包括將無(wú)細(xì)胞百日咳原 液、精制白喉類(lèi)毒素、精制破傷風(fēng)類(lèi)毒素加入氫氧化鋁吸附后再加入B型流感 嗜血桿菌莢膜多糖原液，然后使用生理鹽水稀釋?zhuān)尤肓蛄{(diào)節(jié)pH值至5.8， 加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺EDC反應(yīng)1小時(shí)；再調(diào)節(jié)pH至7.0， 然后降溫至4℃，最后透析、超濾濃縮后除菌，于4℃保存。