[發明專利]一種羊鞏膜膠原蛋白的提取方法、眼用凝膠及其制備方法

在審

• 申請號: 201610076074.2
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105617350A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發明（設計）人: 王媛
• 申請（專利權）人: 王媛
• 主分類號: A61K38/01
• 分類號: A61K38/01;A61K9/06;A61P27/10;A61K35/30
• 代理公司: 北京馳納智財知識產權代理事務所(普通合伙) 11367
• 代理人: 蔣路帆

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及一種羊鞏膜膠原蛋白的提取方法、眼 用凝膠及其制備方法。

背景技術

膠原蛋白屬大分子蛋白質，其超微結構單位是膠原纖維，由于各型膠原蛋 白的聚合方式不同,決定了它們功能各異。人眼鞏膜由細胞外基質及少量細胞 組成，膠原纖維是細胞外基質的重要組成部分，約占鞏膜干重的75％。淺層鞏 膜膠原纖維的直徑為166nm，深層鞏膜膠原纖維的直徑為100nm。在眼球的不 同部位，膠原纖維束排列的方式不同：在眼球前部近角膜緣處、眼球后部視乳 頭周圍，包括睫狀后短動脈及神經穿入鞏膜的部位，膠原纖維束呈環形排列， 少部分呈網狀，適于作為力的支點、眼外肌附著；從眼球前部近角膜緣至眼球 后部的近鞏膜篩板,膠原纖維束排列的總趨勢為前后方向(子午線方向)，其中 后極部鞏膜網狀纖維較多，有一定的可擴張性。此外，膠原纖維使鞏膜具很強 韌性，在對抗眼內壓故膠原對于維持眼球形態結構方面起到重要作用。當后極 部膠原蛋白不足時，眼球后極部膠原纖維排列發生紊亂，鞏膜會出現韌性降 低，可擴張性增加，對眼球產生不利影響。也就是說，膠原蛋白是維持眼球正 常形態，眼軸正常長度，鞏膜正常厚度所不可缺少的重要成分，是防止眼球后 極部鞏膜進一步延長，厚度進一步變薄，后鞏膜葡萄腫發生的物質。因此，外 源性補充膠原蛋白可以預防近視的進一步發展，對病理性近視的治療有很大的 幫助。

膠原蛋白是人體內含量最豐富、分布最廣泛的一組硬蛋白，其具有低免疫 源性、生物可降解性和促細胞生長等諸多的生物學特性，在臨床上可作為藥物 載體治療各種眼病，促進眼角膜上皮損傷的修復和角膜傷口的愈合，是一種良 好的眼用藥物制劑。但目前使用的膠原蛋白大多數來自于動物組織、皮膚等的 提取物，如動物的皮、肌腱、軟骨、鱗片等，具有傳染疾病、引起排斥反應、 分子量大等缺陷。

發明內容

為克服現有技術中眼用膠原蛋白具有傳染疾病、引起排斥反應、分子量大 等缺陷問題，本發明利用酶水解-鹽提取法，提供了一種從羊鞏膜中提取膠原蛋 白制備羊鞏膜膠原蛋白眼用凝膠，包括羊鞏膜膠原蛋白、硼酸、硼砂、聚乙烯 醇、氯化鈉、吐溫、注射用水、防腐劑；其中，羊鞏膜膠原蛋白的質量分數為 80％～90％，防腐劑的質量分數為0.01％～2％，硼酸和硼砂的質量分數為 0.5％～2％，聚乙烯醇的質量分數為0.5％～2％，氯化鈉的質量分數為0.5～ 2％，吐溫質量的分數為0.3％～2％，注射用水的質量分數為余量。

其中，所述羊鞏膜膠原蛋白的提取方法包括以下步驟：

1)將離體的羊眼球去掉除鞏膜以外的其他部分，分離出羊鞏膜；

2)將步驟1)中得到的羊鞏膜切成羊鞏膜片；用生理鹽水浸泡清洗羊鞏膜 片，去除血清和脂肪后，用蒸餾水漂洗，在無菌環境下晾干，得到羊鞏膜干 片；

3)取所述羊鞏膜干片，加入胃蛋白酶，所述胃蛋白酶的質量為羊鞏膜干片質 量的10％，放入勻漿機內進行勻漿后，放在磁力攪拌機上攪拌提取24h～26h；

4)用高速冷凍離心機在溫度為0～4℃，轉速為6000轉/min的條件下離心 10～30min，取第一次上清溶液，并得到沉淀；

5)將步驟4)中離心得到的沉淀加入0.5mol/L乙酸懸浮溶解，放在磁力攪拌 機上攪拌提取24h～26h，用高速冷凍離心機在溫度為0～4℃，轉速為6000轉 /min的條件下離心10～30min，取第二次上清溶液；

6)合并所述第一次上清溶液和所述第兩次上清溶液，緩慢加入堿性溶液調節 pH值至5，濾掉沉淀物，在剩余的溶液中加入氯化鈉固體粉末，緩慢攪拌，在 4℃下，靜置8～14小時形成羊鞏膜膠原蛋白原液；

7)將羊鞏膜膠原蛋白原液放置于高速冷凍離心機中，在溫度為0～4℃，轉 速為6000轉/min，時間為10～30min的條件下離心，取沉淀，用稀醋酸溶解， 將溶解液裝入透析袋中，分別用梯度濃度的乙酸溶液各透析24～26小時，然后 用蒸餾水透析24～26小時，每24～26小時更換透析液兩次，得到羊鞏膜膠原 蛋白水溶液；

8)將羊鞏膜膠原蛋白水溶液在-20℃～-80℃下冷凍干燥，制得到羊鞏膜膠原 蛋白。

步驟6)中所述堿性溶液為6mol/L的NaOH或6mol/L的KOH。