[發明專利]一種修復多環芳烴污染土壤酶制劑的制備方法

在審

• 申請號: 201610076034.8
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105524889A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 周麗花;張帆;林大偉
• 申請（專利權）人: 常州市鼎日環保科技有限公司
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N1/36;C12N1/20;B09C1/10;C12R1/01
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技術領域

本發明公開了一種修復多環芳烴污染土壤酶制劑的制備方法，屬于酶制劑制備技術領域。

背景技術

酶制劑是指從生物中提取的具有酶特性的一類物質，主要作用是催化食品加工過程中各種化學反應，改進食品加工方法。中國已批準的有木瓜蛋白酶、α—淀粉酶制劑、精制果膠酶、β—葡萄糖酶等6種。酶制劑來源于生物，一般地說較為安全，可按生產需要適量使用。

多環芳烴是指兩個或兩個以上的苯環按一定順序排列組成的碳氫化合物，如菲、芘、苯并芘等，具有強烈致癌、致畸和致突變特性，土壤中的多環芳烴主要以4～6環多環芳烴為主。由于人類對石化產品的不斷開發利用，多環芳烴持續向環境中排放，高溫過程形成的多環芳烴大都排放到大氣中，隨著大氣環流、大洋環流等循環而不斷擴散，空氣、土壤及水體甚至南極及高山冰川等都受到了多環芳烴的污染。多環芳烴和其它固體顆粒物等結合在一起，通過干、濕沉降轉入湖泊、海洋，最終主要在沉積物、有機物質和生物體中累積，對人類健康和整個生態系統構成威脅。

土壤中的多環芳烴主要來源于大氣中多環芳烴干濕沉降、工業污水的排放、輸油管道及蓄油設備等的滲漏，一般污染區多環芳烴濃度在10³～10⁴μg/kg范圍內，但是在重工業區，油田附近等重污染區土壤中多環芳烴的含量就會大大增加，土壤中的多環芳烴通常與其他有機污染物或重金屬同時存在引起復合污染，而且，土壤中的多環芳烴還很容易遷移進入地下水，對人類生活造成很大威脅。

目前土壤中的多環芳烴的去除過程中，利用化學及物理方法通常會引起二次污染或除去不徹底，如化學氧化或光解多環芳烴時，由于化學能、光能對中間產物的激發作用，會生成毒性更大的中間產物，物理方法通常不能徹底降解多環芳烴，然而另外一種微生物降解就能避免以上弊端。

微生物降解是環境中多環芳烴的分解的后主要途徑，是目前研究較多也相對成熟的一種技術，而且國內已經有多個現場示范修復多環芳烴污染場地的報道，而且也有較高的修復效率，但是，微生物修復的周期較長，一般以年為周期，在微生物細胞內需要幾十種酶的先后催化才能降解為H₂O和CO₂，而且土壤污染的微生物修復過程中，加入到修復現場環境中的微生物受環境因子、土著菌競爭，而且由于多環芳烴的水不溶性，造成土壤環境中微生物對多環芳烴吸收降解效率較低，微生物修復過程中存在多環芳烴半衰期長的缺點。

發明內容

本發明主要解決的技術問題：針對目前土壤中多環芳烴在去除的過程中，利用化學及物理方法通常會引起二次污染或者去除不徹底，而微生物降解法雖比較成熟，修復效率高，但其修復周期較長，一般以年為周期，且利用微生物細胞內多種酶催化進行降解時，必須在微生物體內進行，而微生物在待修復土壤中易受環境因子、土著菌競爭，導致吸收降解效率降低的現狀，提供了一種通過培養醋酸鈣不動桿菌制得菌絲懸浮液，經化學破碎，透析濃縮得濃縮酶液，經硅藻土負載后干燥，從而得到修復多環芳烴污染土壤酶制劑的制備方法。該方法不僅操作簡便，不會引起二次污染，而且利用微生物體內提取出可以降解多環芳烴污染物的胞外酶，用載體對其進行固定，制備出可以直接應用于污染物質降解的酶制劑，提高了降解效率，且修復周期短，不易受到環境影響，修復徹底，具有優異的處理性能，適合大規模生產應用。。

為了解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是：

（1）按接種量為8～10%將醋酸鈣不動桿菌接種于含200～300mg/kg多環芳烴污染土壤的液體無機鹽培養基中，在30～40℃下恒溫搖床振蕩培養1～2周，將菌種馴化以及活化；

（2）再將上述活化后的菌種用接種環轉接到含100～150mg/kg多環芳烴污染土壤的牛肉膏蛋白胨液體培養基中，放入恒溫箱，在35～45℃下恒溫培養7～9天；

（3）待菌種培養結束后，用無菌水緩慢淋洗菌絲表面5～10min，收集淋洗液，得到菌絲懸浮液，放入臥式離心機中，在4～6℃下以6000～8000r/min的轉速離心5～10min分離去除上清液，得到濕菌體；

（4）稱將50～60g上述得到的濕菌體裝入500mL燒杯中，向其中加入300～400mL質量濃度為30%鹽酸胍溶液，放置在超聲振蕩儀中，以200～300W功率超聲振蕩處理2～4h，再以10000～12000r/min的轉速離心3～5min分離去除細胞碎片，將上清液轉入透析袋，用流動蒸餾水透析濃縮至透析液不再渾濁，得濃縮酶液；