[發(fā)明專利]一種等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學參數(shù)的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201610075754.2
• 申請日: 2016-02-03
• 公開（公告）號: CN105675797A
• 公開（公告）日: 2016-06-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 廖丹葵;彭尚;周利琴;孫麗霞;孫建華;廖彭瑩;劉彭如;童張法
• 申請（專利權(quán)）人: 廣西大學
• 主分類號: G01N31/16
• 分類號: G01N31/16;G01N25/48
• 代理公司: 深圳新創(chuàng)友知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44223
• 代理人: 江耀純

【技術(shù)領(lǐng)域】

本發(fā)明涉及一種酶促反應(yīng)動力學參數(shù)檢測技術(shù)，特別涉及一種等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學參數(shù)的方法。

【背景技術(shù)】

酶促反應(yīng)動力學參數(shù)在研究酶促反應(yīng)中起著非常重要的作用。K_m是酶的特征常數(shù)，只與酶的性質(zhì)有關(guān)而與酶的濃度無關(guān)。且K_m可以反應(yīng)酶同底物的親和力，K_m越小，酶同底物的親和力越大。因此，在實際應(yīng)用中，通過測定K_m，可以鑒別不同來源或相同來源但在不同發(fā)育階段，不同生理狀態(tài)下催化相同反應(yīng)的酶是否屬于同一種酶；也是通過K_m的不同，找出酶的最適底物和底物的最適反應(yīng)濃度；還可以判斷反應(yīng)方向或趨勢、不同抑制劑對酶的抑制類型等等。

根據(jù)米氏方程，測定米氏常數(shù)K_m和最大酶促反應(yīng)速率v_max，需要測定不同濃度的酶催化反應(yīng)速率，反應(yīng)速率為底物濃度不足以產(chǎn)生最大速率時的反應(yīng)初速率。在測定中，需要定義反應(yīng)多久測出的速率才是初速率，反應(yīng)時間過短，終止反應(yīng)時產(chǎn)生的誤差越大；反應(yīng)時間過長，終止反應(yīng)后所得偏小；且在終止反應(yīng)速率操作中，人為誤差難以避免，因此造成米氏常數(shù)的測定存在較大偏差。在酶促反應(yīng)之后，還需分析手段對產(chǎn)物進行定量測定，最后才能確定反應(yīng)速率的大小。該類方法較為繁瑣且有一定的局限性，比如在蛋白濃度較高時光譜測定往往非常不準確，某些酶轉(zhuǎn)化率非常低產(chǎn)物較難用直接的方法測定其含量。

等溫滴定量熱法(ITC)是用于量化研究各種生物分子相互作用的一種技術(shù)，它可實時直接測量生物分子結(jié)合過程中釋放或吸收的熱量。通過測量結(jié)合過程中的熱流變化，就能夠準確地確定酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)K_m和最大酶促反應(yīng)速率v_max。等溫滴定量熱法(ITC)具有快速、微量、靈敏、操作簡單的優(yōu)點，且需藥品更少，準確，做到實時監(jiān)測，可克服傳統(tǒng)方法的缺陷，解決酶促反應(yīng)動力學參數(shù)測定的繁瑣和準確性的難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

本發(fā)明提供一種等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學參數(shù)的方法，以解決酶促反應(yīng)動力學參數(shù)測定的繁瑣和準確性等問題。本發(fā)明的方法具有快速、微量、靈敏、操作簡單的特點，可有效降低酶促動力學參數(shù)測定中對酶和底物的消耗，簡化測定酶促反應(yīng)過程，提高結(jié)果的準確性。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學參數(shù)的方法，是通過將底物滴加到含酶的溶液中，檢測出每次滴加后底物與酶反應(yīng)的熱功率，設(shè)定滴加底物的間隔時間，計算出不同底物濃度時熱功率的變化，測定得到酶促反應(yīng)的米氏常數(shù)K_m和最大酶促反應(yīng)速率v_max。

進一步地，所述的等溫滴定量熱法測定酶促反應(yīng)動力學參數(shù)的方法，包括以下步驟：

S1：配制0.1mol/L的緩沖液；

S2：用步驟S1配制好的緩沖液配制0.5μmol/L的酶溶液和10-15mmol/L底物溶液；

S3：將步驟S2配制好的酶溶液、底物溶液分別注入量熱池和注射器中，在轉(zhuǎn)速300r/min下攪拌酶溶液，待量熱儀達到溫度為298.15-313.15K并基線穩(wěn)定平衡后自動開始滴加底物溶液至酶溶液中，計算出不同底物濃度時熱功率的變化，測定得到各個溫度的米氏常數(shù)K_m和最大酶促反應(yīng)速率v_max。

更進一步地，步驟S1中所述緩沖液為硼酸溶液。

更進一步地，步驟S1中所述緩沖液的pH值為8.3。

更進一步地，步驟S1中所述緩沖液含0.3mol/L的氯化鈉溶液。

更進一步地，步驟S1中所述緩沖液經(jīng)孔徑為0.22μm過濾膜過濾所得。

更進一步地，步驟S2中所述酶為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，所述底物為馬尿酸-組氨酸-亮氨酸。

更進一步地，步驟S3中將酶溶液注入量熱池中的體積為164μL。

更進一步地，步驟S3中所述量熱儀為等溫滴定量熱儀。

更進一步地，步驟S3中所述底物溶液滴加至酶溶液中共20滴，每滴體積為1μL，每滴時間間隔為60s，測定時間為1200s。