[發明專利]一種篩選甘蔗耐旱變異株的方法

有效

• 申請號: 201610064813.6
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105706923B
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 呂平;檀小輝;張繼;韋麗君;黃強;黃秋偉;龐新華;金剛;黃顯雅
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京中譽威圣知識產權代理有限公司11279
• 代理人: 王正茂

1.一種篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)甘蔗的愈傷組織培養：將長至10-20cm蔗芽取下消毒滅菌后接種到誘導培養基上誘導愈傷組織，每瓶接4-5圓片，先暗培養，連續培養10d，后進行光照培養10h/天，連續培養15d，得到愈傷組織；

(2)甘蔗的胚性愈傷培養：將步驟(1)中得到的愈傷組織轉至繼代培養基上進行繼代增殖，繼代3次，每次培養20d，光照培養10h/天，培養后挑選結構疏松、顏色淡黃的愈傷組織，結合顯微鏡進行選擇，篩選出甘蔗胚性細胞；

(3)甘蔗愈傷懸浮培養與選擇：將步驟(2)中得到的甘蔗胚性細胞接種到含1.0-3.0mg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養基中，在搖床以120rpm的轉速進行震蕩培養，光照培養10-14d，將得到的細胞團塊轉移至離心管中以8000rpm的轉速離心10min，將離心沉淀物剔除褐化、已死亡細胞及大細胞團塊后轉接到含2.0mg/L 2，4-D、0.1mg/L NAA的MS培養基，在搖床上120rpm震蕩培養2-4d，得到比較分散的懸浮物，先用孔徑50目細胞篩濾去較大孔徑的愈傷組織，再用孔徑為80-150目的細胞篩濾，即得到直徑0.10-0.22mm的較分散的微小細胞粒；

(4)斑茅總DNA與甘蔗細胞懸浮共培養：將步驟(3)中得到的微小細胞粒轉移至含1.0-2.0mg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養基上，并加入斑茅總DNA，總DNA的濃度為200-400μg/mL，將甘蔗愈傷微小細胞粒與斑茅總DNA在搖床120rpm的轉速進行懸浮共培養，先暗培養2d，再光照培養3d，得到細胞培養物；

(5)將步驟(4)得到的細胞培養物轉移至含有質量百分比為20％PEG、1.0mg/L 2，4-D的MS培養基上進行光照培養7d，將培養物再轉入含10％PEG、2.0mg/L 2，4-D的MS培養基上進行光照培養10d；

(6)將步驟(5)得到的細胞培養物在分化培養基上進行分化培養，光照培養分化出不定芽，培養時間20d，將芽在含30％PEG的MS培養基上再培養，光照培養20d，得到再生植株；

(7)將步驟(6)獲得的再生植株在生根培養基上進行生根培養，光照培養20d，經過SRAP分子檢測鑒定，初步獲得耐旱的甘蔗變異株試管苗；

(8)將步驟(7)獲得的耐旱的甘蔗變異株試管苗進行苗期水分脅迫處理，剔除不耐旱或表現不良的植株，最后獲得耐旱甘蔗植株；

所述的MS培養基均需添加30g/L蔗糖；所述的光照培養是指日光燈光照、光照強度為2000-3000Lux；所述的暗培養是指全天遮光處理；所述的光照培養、暗培養的溫度為26±2℃；

步驟(1)中所述的消毒滅菌的具體操作為：取無病害、生長健壯的甘蔗莖稍，流水沖洗，剝去外圍葉片，在超凈工作臺上，用解剖刀逐層剝葉，每剝1次用75％的酒精表面消毒1次，留下0-2cm新葉，切成1-2mm厚圓片。

2.根據權利要求1所述的篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，步驟(1)中所述的誘導培養基為含2.0-3.0mg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養基。

3.根據權利要求1所述的篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，步驟(2)中所述的繼代培養基為含1.0-2.0mg/L 2，4-D、0.1-0.2mg/L NAA的MS培養基。

4.根據權利要求1所述的篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，步驟(4)中所述的斑茅總DNA是采用SDS方法提取斑茅葉片的總DNA。

5.根據權利要求1所述的篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，步驟(5)、步驟(6)中所述的PEG為聚乙二醇6000。

6.根據權利要求1所述的篩選甘蔗耐旱變異株的方法，其特征在于，步驟(6)中所述的分化培養基為含質量百分比為20％PEG、1.0mg/L BA的MS培養基。