[發(fā)明專利]一種高效檢測水稻抗性基因Pita的特異性引物、分子標記及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610064583.3
• 申請日: 2016-02-01
• 公開（公告）號: CN105506152B
• 公開（公告）日: 2019-02-12
• 發(fā)明（設計）人: 劉立娜;李成云;楊靜;張寒
• 申請（專利權）人: 云南農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司 53115
• 代理人: 賽曉剛

本發(fā)明涉及一種高效檢測水稻抗性基因Pita關鍵抗病位點的特異性引物、分子標記及其檢測方法，屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術應用領域。所述特異性引物是由前引物(6640F)和后引物(7415R)組成，前后引物所包含的兩個可變核苷酸位點在大樣本群體中的連鎖比率達到99.31％，表明該引物對在水稻中具有廣泛的適用性。本發(fā)明設計的引物配合篩選出的專用PCR反應體系和反應條件，極大地增加了擴增的準確性和特異性，有效地解決了前人所使用的引物在檢測過程中的假陽性問題。利用本發(fā)明設計的特異性引物及其分子標記檢測水稻Pita基因的抗/感病類型時，只需要進行一次PCR擴增，此方法具有簡單、快捷、經(jīng)濟節(jié)約的優(yōu)點，適合在大樣本中快速篩選、分析具抗病基因型的個體和品種。

技術領域

本發(fā)明涉及一種高效檢測水稻抗性基因Pita關鍵抗病位點的特異性引物、分子標記及其檢測方法，屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術應用領域。

技術背景

稻瘟病是造成水稻嚴重減產(chǎn)的主要病害之一，每年因稻瘟病導致的生產(chǎn)損失約占總產(chǎn)量的10～15％。目前，發(fā)掘廣譜稻瘟病抗性基因，通過育種培育廣譜持久抗病的水稻品種是控制稻瘟病的主要措施。因此，稻瘟病抗性基因的檢測以及稻瘟病抗性水稻種質(zhì)篩選就顯得尤為重要。

抗病基因相關的分子標記在遺傳育種方面具有重要的意義，分子標記輔助育種(marker-assisted selection,MAS)對于幼苗的篩選和基因型的確定具有簡單、快捷、經(jīng)濟節(jié)約的優(yōu)點，適合在大樣本中篩選、分析具抗性基因的個體和品種。

水稻對稻瘟病的抗性符合基因?qū)驅(qū)W說。目前在基因?qū)驅(qū)W說中水稻的抗性基因Pita和稻瘟菌的無毒基因AVR-Pita是研究得最為詳盡的一對互作關系。AVR-Pita編碼223個氨基酸的金屬蛋白酶，能與抗性基因Pita產(chǎn)物直接作用。Pita是第一個被克隆的抗性基因。Pita基因編碼一個長度為928氨基酸的細胞質(zhì)膜受體蛋白，該蛋白含核苷酸結合位點結構域(NBS)和富亮氨酸結構域(LRD)。

Pita基因抗病/感病兩種基因型的編碼產(chǎn)物僅有一個氨基酸的差異，即第918氨基酸由抗病型的丙氨酸突變?yōu)楦胁⌒偷慕z氨酸，抗病型的Pita基因編碼產(chǎn)物的LRD(包含918氨基酸位點)能與稻瘟病菌無毒基因AVR-Pita編碼產(chǎn)物相互作用，引起水稻防衛(wèi)響應和細胞程序性死亡，從而免受稻瘟病菌侵染。而感病型的Pita基因編碼產(chǎn)物則不能與AVR-Pita編碼產(chǎn)物相互作用，導致感病(Bryan et al.,2000；Jia et al.,2000)。

Pita 918氨基酸的改變是由于Pita基因DNA序列的6640位點(GenBankNo.AF207842)的突變引起的，當該位點核苷酸為G時，所在密碼子編碼丙氨酸，抗病；當該位點為T時，所在密碼子編碼絲氨酸，感病(Jia et al.,2003)。這種由DNA堿基的一個差異所造成抗/感病差異，為使用PCR引物進行帶有抗病位點的品種的篩選提供了有利條件，是分子標記輔助育種的經(jīng)典應用。

Jia等人曾根據(jù)Pita基因DNA位點的變異以及6640位點與6276位點的連鎖，設計了檢測6640位點核苷酸變異的特異性引物(YL100/YL102)(Jia et al.,2002)。但是發(fā)明人也發(fā)現(xiàn)原設計特異性引物識別具有假陽性的現(xiàn)象，也就是說有時候不管6640位點是G還是T，該引物都能擴增出相應的DNA片段，這就導致該分子標記不具有嚴格的特異性，要進一步確認6640位點的狀況還需要通過DNA測序的方式進行確認,顯得耗時、耗力、昂貴；此外，Jia等人的引物所基于的兩個變異位點(6640和6272)在世界范圍內(nèi)其它地區(qū)水稻樣本中連鎖率很低，導致他們的引物不可用于其它地區(qū)水稻的Pita抗性基因型檢測。

因此，為了更加準確和更加廣泛地利用特異性引物檢測Pita基因關鍵抗病位點6640的變異，本發(fā)明擬通過大規(guī)模實驗篩選和數(shù)據(jù)分析，對識別該位點的特異性PCR引物、實驗反應體系和實驗反應條件進行設計、實驗和優(yōu)選，提供一種快速、準確、特異性強的檢測Pita基因抗病基因型的專用引物。

參考文獻：