[發(fā)明專利]用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒及應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610063552.6
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105525015A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發(fā)明（設計）人: 胡金強;雷俊婷;白艷紅;景建洲;高輝;耿堯;孫新城;董彩文;姜春鵬
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州輕工業(yè)學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 鄭州優(yōu)盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 41125
• 代理人: 張紹琳;張真真

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種食品安全檢測技術(shù)，具體涉及用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒及應用。

背景技術(shù)

沙門氏菌(Salmonellaspp.)是近年來國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要引起人類傷寒、急性腸胃炎、菌血癥與敗血癥等病癥。該菌分布廣泛，多種動物上都分離到該菌，尤其是廣泛存在于鴨、鵝等水禽及其蛋類之中，帶菌率為30％-40％，家畜與家禽的生前感染與宰后易受污染。人類感染主要是由于食品、飲用水以及環(huán)境受到沙門氏菌污染引起的，根據(jù)我國疾病預防控制中心公布的中國內(nèi)陸地區(qū)食源性致病菌導致疾病人數(shù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)，感染沙門氏菌的病例在整個細菌性食物中毒病例中占據(jù)首位。因此國內(nèi)外對沙門氏菌的監(jiān)測都非常重視。大腸桿菌O157:H7(EscherichiacoliO157:H7)也是近年來國內(nèi)外廣泛重視的人畜共患病原菌，主要引起腹瀉、出血性腸炎與嚴重繼發(fā)溶血性尿毒綜合癥等病癥。該菌分布廣泛，人與動物的排泄物是大腸桿菌O157:H7的重要傳播載體。多種動物上都分離到該菌，尤其是大腸桿菌O157:H7能寄生于牛、豬、雞、羊、狗等家畜，通過蒼蠅、蟑螂和蚊子等媒介動物傳播，隨著人和動物的排泄物污染生活用水、湖泊、河流等地表水傳播以及人與帶菌家禽等的接觸傳播等。人類感染主要是由于大腸桿菌O157:H7污染的食品、飲用水以及環(huán)境引起，20世紀末，我國河南、安徽、江蘇等地都有大腸桿菌O157:H7大面積暴發(fā)，疫情廣泛、嚴重，確診人數(shù)總計達2萬人，導致177人死亡。大腸桿菌O157:H7感染的病例在整個細菌性食物中毒病例的致死率居于前列。因此國內(nèi)外對大腸桿菌O157:H7的監(jiān)測都非常重視。

目前檢測食品中致病菌的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，但是常規(guī)的分離培養(yǎng)與生化鑒定耗時費力、敏感性不高、所需時間長，不利于暴發(fā)疫情時的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測所要求的快速、準確的原則。盡管國內(nèi)外對沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的診斷技術(shù)已進行較為廣泛與深入的研究，但缺乏快速、簡便、經(jīng)濟的檢測技術(shù)。近年來發(fā)展起來的PCR技術(shù)，是一種快速、敏感、特異的檢測技術(shù)，然而由于該技術(shù)判定反應結(jié)果時的凝膠電泳易造成污染并需要接觸有毒性的染料而具有局限性。此外，熒光定量PCR技術(shù)也因其敏感性高、特異性強而得到廣泛應用，該法的局限性表現(xiàn)在設備昂貴、成本高與熒光探針保存時間較短等方面。上述方法在高通量檢測方面也顯得較為繁瑣，RiboPrinter全自動細菌鑒別系統(tǒng)(BAX系統(tǒng))與基因芯片技術(shù)能夠進行高通量的檢測，不過前者儀器本身及所用耗材與試劑均較昂貴，后者的檢測穩(wěn)定性較差，這些方法均不能滿足對沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7快速、準確、穩(wěn)定、經(jīng)濟、高通量的實際檢測需求。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：目前檢測食品中致病菌的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，但是常規(guī)的分離培養(yǎng)與生化鑒定耗時費力、敏感性不高、所需時間長，不利于暴發(fā)疫情時的快速診斷，也不符合臨床病原菌檢測所要求的快速、準確的原則。本發(fā)明針對上述缺陷，目的在于提供一種敏感性高、特異性強、方便快捷的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測的試劑盒及應用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，所述試劑盒包含引物組、探針、PCR模板、PCR反應液以及ELISA反應液。

所述引物組由沙門氏菌引物對和大腸桿菌引物對組成。

所述引物組具體為，沙門氏菌上游引物如SEQIDNO：1所示，下游引物如SEQIDNO：2所示；大腸桿菌上游引物如SEQIDNO：3所示，下游引物如SEQIDNO：4所示。

所述沙門氏菌上游引物和大腸桿菌上游引物的5’端均為地高辛標記。

所述探針包括沙門氏菌探針如SEQIDNO：5所示、大腸桿菌探針如SEQIDNO：6所示。

所述沙門氏菌探針和大腸桿菌探針的3’端均為生物素標記。

所述PCR模板為DNA，由增菌培養(yǎng)液培養(yǎng)而成。

所述PCR反應液包括PCRbuffer、MgCl₂、dNTPs、TaqDNA聚合酶和ddH₂O。

一種用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒的應用，其特征在于，按照以下步驟進行：