[發明專利]用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201610063552.6
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN105525015A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 胡金強;雷俊婷;白艷紅;景建洲;高輝;耿堯;孫新城;董彩文;姜春鵬
• 申請（專利權）人: 鄭州輕工業學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12R1/19;C12R1/42
• 代理公司: 鄭州優盾知識產權代理有限公司 41125
• 代理人: 張紹琳;張真真

1.一種用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組分為：引物組、探針、PCR模板、PCR反應液以及ELISA反應液。

2.如權利要求1所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述引物組由沙門氏菌引物對和大腸桿菌O157引物對組成。

3.如權利要求1或2所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述引物組具體為，沙門氏菌上游引物如SEQIDNO：1所示，下游引物如SEQIDNO：2所示；大腸桿菌O157上游引物如SEQIDNO：3所示，下游引物如SEQIDNO：4所示。

4.如權利要求1或3所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述沙門氏菌上游引物和大腸桿菌O157上游引物的5’端均為地高辛標記。

5.如權利要求1所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述探針包括沙門氏菌探針如SEQIDNO：5所示、大腸桿菌O157探針如SEQIDNO：6所示。

6.如權利要求1或5所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述沙門氏菌探針和大腸桿菌O157探針的3’端均為生物素標記。

7.如權利要求1所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR模板為DNA，由增菌培養液培養而成。

8.如權利要求1所述的用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液包括10×PCRbuffer、MgCl₂、dNTPs、TaqDNA聚合酶和ddH₂O。

9.一種用于沙門氏菌與大腸桿菌O157:H7的多重PCR-ELISA檢測試劑盒的應用，其特征在于，按照以下步驟進行：

（1）多重PCR：PCR模板各1μL，10pmol/μL沙門氏菌上下游引物各0.3μL，10pmol/μL大腸桿菌上下游引物各0.4μL，10×PCRbuffer2.5μL，25mmol/LMgCl₂1.5μL，2.5mmol/LdNTPs0.3μL，5U/μLTaq酶0.8μL，ddH₂O定容至25μL；反應程序為94℃變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，30個循環，72℃延伸7min，各物料的用量可同比例放大或縮??；

（2）以含有8mg/L鏈霉親和素的包被液，包被酶標板，200μL/孔，4℃包被過夜，甩干后以含0.5mL/LTween-20的PBST洗板5次，250μL/孔，每次靜置3min，甩干，所述包被液為0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.8；

（3）40μL變性液中加入5μL地高辛標記的PCR產物，混勻，室溫靜置30min，再加入200μL50pmol/L生物素標記的探針，混勻，每孔加入上述雜交液200μL，55℃2h，洗板，所述變性液為100mmol/LNaOH溶液，750mmol/LNaCl；

（4）加入100μL以PBS按1:5000稀釋的HRP標記的抗地高辛抗體，37℃1h，洗板5次；

（5）加入50μL臨時配制的1mg/mLTMB顯色液，室溫避光顯色10min，加入20μLH₂SO₄終止。