[發(fā)明專利]一種基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增（RAA）法進(jìn)行熒光定量計(jì)算的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610060128.6
• 申請(qǐng)日: 2016-01-27
• 公開（公告）號(hào): CN107016258B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 應(yīng)清界;應(yīng)若晨;郭利川;王秀東;王智宏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 應(yīng)清界;應(yīng)若晨;王智宏
• 主分類號(hào): G16B20/10
• 分類號(hào): G16B20/10
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開了一種基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RAA)法進(jìn)行熒光定量計(jì)算的方法，是針對(duì)RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)特點(diǎn)，建立了一套數(shù)學(xué)模型及計(jì)算方法，可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量檢測(cè)擴(kuò)增起始模板量，更好的應(yīng)用及推廣RAA核酸擴(kuò)增技術(shù)，使RAA技術(shù)更快更準(zhǔn)更廣的應(yīng)用于現(xiàn)代化的農(nóng)業(yè)、醫(yī)學(xué)、食品安全、檢驗(yàn)檢疫、疾控防治、環(huán)境微生物鑒定等領(lǐng)域的檢測(cè)和科研。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增(RAA)法進(jìn)行熒光定量計(jì)算的方法，用該方法可以對(duì)核酸擴(kuò)增起使量進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

背景技術(shù)

在生物學(xué)研究和分子診斷中，DNA擴(kuò)增是一種基本和必要的技術(shù)手段，其中最常用的是利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(英文全稱：Polymerase Chain Reaction，簡(jiǎn)稱PCR)進(jìn)行核酸體外擴(kuò)增，該技術(shù)于1983年由美國(guó)科學(xué)家PE(Perkin Elmer珀金-埃爾默)公司遺傳部的Dr.Mullis發(fā)明，山于PCR技術(shù)在理論和應(yīng)用上的跨時(shí)代意義，因此Mullis獲得了1993年化學(xué)諾貝爾獎(jiǎng)，目前已被廣泛運(yùn)用于現(xiàn)代化的農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)以及食品工業(yè)等領(lǐng)域。通過(guò)這一技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)微量核酸的高效擴(kuò)增，將極少量的特異核酸序列分子擴(kuò)增到儀器可以檢測(cè)到的水平。

PCR技術(shù)核酸擴(kuò)增分三個(gè)基本反應(yīng)步驟，分別是變性、退火(復(fù)性)和延伸；具體為：

①模板DNA變性：模板DNA經(jīng)加熱至90-95℃一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解旋，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55-60℃，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在DNA聚合酶的作用下，于70-75℃，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈；

完成以上三個(gè)過(guò)程稱為一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每完成一個(gè)循環(huán)，理論上都可以增加一倍的核酸數(shù)量，經(jīng)過(guò)不斷重復(fù)以上的循環(huán)，可以將微量的核酸擴(kuò)增到可以用儀器檢測(cè)的水平。一般而言，每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘，2-3小時(shí)才能將目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍，達(dá)到可以檢測(cè)到的水平。

PCR可對(duì)特定核苷酸片斷進(jìn)行指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增，無(wú)論定性還是定量分析，分析的都是PCR終產(chǎn)物。但是在許多情況下，人們感興趣的是未經(jīng)PCR信號(hào)放大之前的起始模板量。例如想知道某一動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)或者某一特定基因在特定組織中的表達(dá)量，在這種需求下熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，熒光定量應(yīng)用領(lǐng)域也更加廣泛。

熒光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種定量測(cè)定技術(shù)。

熒光定量PCR的原理是在PCR擴(kuò)增時(shí)加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；剛開始時(shí)，探針結(jié)合在DNA任意一條單鏈上：PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5’端-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。

基于以上的原理熒光定量PCR是建立一種數(shù)學(xué)模型和一種計(jì)算方法來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增過(guò)程中的起始模板量計(jì)算。

在熒光定最PCR中，在指數(shù)擴(kuò)增期內(nèi)，理想狀態(tài)下，第n個(gè)循環(huán)后的熒光量只與起始模板量、循環(huán)數(shù)和擴(kuò)增效率相關(guān)。它們之間的關(guān)系可以表示為：