[發(fā)明專利]一種基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增（RAA）法進行熒光定量計算的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610060128.6
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN107016258B
• 公開（公告）日: 2020-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 應(yīng)清界;應(yīng)若晨;郭利川;王秀東;王智宏
• 申請（專利權(quán)）人: 應(yīng)清界;應(yīng)若晨;王智宏
• 主分類號: G16B20/10
• 分類號: G16B20/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增RAA法進行熒光定量計算的方法，其特征在于：基于RAA核酸擴增技術(shù)特點，用熒光定量的方法對核酸擴增起始模板量進行準(zhǔn)確定量，在RAA反應(yīng)過程中實現(xiàn)每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)熒光量與RAA擴增產(chǎn)物量完全同步，形成一一對應(yīng)關(guān)系，測出熒光量就可以推算出擴增產(chǎn)物量，將此方法定義為熒光定量RAA，且確定RAA擴增為指數(shù)擴增，在指數(shù)擴增期內(nèi)，熒光量只與起始模板量、擴增效率和擴增時間相關(guān)，它們之間的關(guān)系表示為：

F_n＝F₀×(1+E₀)^a，其中F_n為第t分鐘后的熒光量，F(xiàn)₀為起始模板量，E₀為擴增效率，a為與時間相關(guān)的函數(shù)，表示為a＝(t×60)÷b，b是指RAA擴增產(chǎn)物量增加一倍所需的時間，對于特定的擴增，b為常數(shù)，擴增效率E₀也為常數(shù)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增RAA法進行熒光定量計算的方法，其特征在于：熒光定量RAA能利用檢測熒光的儀器將熒光量測定出來，熒光量是一個不斷積累的過程，同時也是與RAA擴增產(chǎn)物一一對應(yīng)的，通過對RAA擴增反應(yīng)中產(chǎn)生的產(chǎn)物熒光信號的實時檢測，通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化；設(shè)置一定時間間隔收集一個熒光強度信號，時間間隔選為5-30秒，將每一時間間隔測到的熒光強度信號連接成曲線，從而得到一條熒光擴增曲線圖；橫坐標(biāo)用時間表示，縱坐標(biāo)用熒光值表示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增RAA法進行熒光定量計算的方法，其特征在于：RAA熒光擴增曲線分為兩個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段，在熒光信號起始階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化；擴增產(chǎn)物也不呈指數(shù)關(guān)系，RAA的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，RAA產(chǎn)物量與起始模板量之間存在指數(shù)函數(shù)關(guān)系，選擇在這個階段進行定量分析；

為了定量方便，定義了三個概念：基線值、熒光閾值和T值；

基線值是指在熒光擴增曲線上熒光背景信號階段，還沒有進入指數(shù)擴增期熒光量的加權(quán)平均值；

熒光閾值是指熒光擴增曲線進入指數(shù)擴增階段的突變點熒光值，經(jīng)過熒光閾值平行于X軸的線定義為閾值線；定義熒光閾值為0-4分鐘之內(nèi)的所有熒光值標(biāo)準(zhǔn)方差的N倍作為熒光閾值，N取大于等于3的整數(shù)；

T值是指擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所需要的時間。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增RAA法進行熒光定量計算的方法，其特征在于：引入T值概念后，原來的指數(shù)函數(shù)可以表示為F_T＝F₀×(1+E₀)^T

由上式可以推出：logF_T＝log[F₀×(1+E₀)^T]

logF₀＝logF_T-Tlog(1+E₀)成立；

T值與起始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始模板量越多，T值越小。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于重組酶介導(dǎo)等溫核酸擴增RAA法進行熒光定量計算的方法，其特征在于：對于特定的目的DNA或RNA通過能測出熒光量的儀器做出已知起始拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的擴增曲線，并設(shè)置熒光閾值，過閾值作X軸的平行線得到閾值線；且閾值線與擴增曲線相交，過交點作X軸的垂線，得到所對應(yīng)的T值。