[發明專利]豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重微滴數字PCR絕對定量檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610059807.1
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105543416A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 陳晨;柴方紅;王楠;于欽磊;穆國冬;馬付坤;閆慧;張靜依
• 申請（專利權）人: 北京佰鷗創投生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

技術領域

本發明涉及試劑盒檢測技術領域，具體的說涉及一種豬流行性腹 瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒數字PCR絕對定量檢測方法和檢測試 劑盒。

背景技術

豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea,PED)是世界范圍內發 生的豬病之一，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特 征。PEDV與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)同屬于尼多病毒目、冠 狀病毒科、冠狀病毒屬，兩種病毒的致病機理以及引起的臨床癥狀極 其相似，給養豬業帶來嚴重危害。這兩種病的主要傳染源是病豬，通 過病豬排泄出的糞便散播病毒，進而污染飼料、飲水和周圍環境，健 康豬只通過口接觸到含有病豬的糞便或其污染物即可發生自然感染。 而且各年齡的豬均易感染，母豬的發病率為15％～90％，而仔豬和育 成豬的發病率通常為100％。病毒傳入豬群的途徑主要是通過運輸病 豬的車輛或者被病毒污染的飼料，以及被病毒污染的鞋、褲、衣物或 其它攜帶病毒的污染物。這兩種病多發生于寒冷季節，主要是在每年 的11月至下年4月間發病，尤其在農歷春節前后更是該病的發病高 峰期。一般情況下氣溫超過20℃不會流行本病，但近年來也有在夏 季發生的病例。

中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所于2005年～2007年間，對國 內部分省、市豬場腹瀉病例進行了RT-PCR檢測，結果表明，豬流 行性腹瀉病(PED)病例占46％、豬傳染性胃腸炎(TGE)病例占 15％、豬輪狀病毒(PoRV)病例占8％，而PED、TGE和PoRV相 互間混合感染的病例占31％。各項研究都表明如何防治死亡率高的豬 流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎，是擺在我們面前的新課題。

目前,對這兩種傳染病的診斷方法主要有病毒中和試驗,免疫熒 光法,免疫電鏡法,ELISA法和RT-PCR法。隨著分子生物學的不斷 發展,ELISA法和RT-PCR法以其敏感性高、特異性強越來越受到人 們的重視。傳統的檢測方法，如病毒中和試驗(VNT)、免疫熒光法、 免疫電鏡法、酶聯免疫吸附試驗等，存在需要時間長、依賴于經驗豐 富的檢測人員、試驗操作復雜、涉及活病毒操作、對檢測環境要求較 高，以及敏感性較低和重復性較差等諸多不足。RT-PCR等核酸檢測 方法，雖然較之傳統方法具有特異性更強、靈敏度更高、自動化程度 更高和結果重復性更好等優勢，但是僅能實現豬傳染性胃腸炎病毒 (TGEV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的定性和半定量檢測，無法對 TGEV和PEDV核酸進行精確的絕對定量檢測，從而檢測結果無法反 映樣品中病毒感染的真實情況。同時RT-PCR方法在靈敏度和特異性 上仍存在一定的局限性，對于病毒核酸提取過程中的某些化學物質較 為敏感，進而抑制PCR反應，出現“假陰性”結果。