[發(fā)明專利]豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610059807.1
• 申請日: 2016-01-28
• 公開（公告）號: CN105543416A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳晨;柴方紅;王楠;于欽磊;穆國冬;馬付坤;閆慧;張靜依
• 申請（專利權(quán)）人: 北京佰鷗創(chuàng)投生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京智為時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

1.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒的特 異性引物和探針組合，其特征在于，包括以下2對特異性引物和2條 與引物對配合使用的特異探針，其核苷酸序列分別為：

PEDV-F1：CACCATCAGCACCTCTTTC；

PEDV-R1：CCAGTGCTCATGATCAAAA；

PEDV-P1：FAM-CGACAACACCGTTACCATTATCTAGGA-BHQ1；

TGEV-F1：CAGGGTAGTGAGTATGATTAC；

TGEV-R1：CAACCTTTGCTCTCGTAA；

TGEV-P1：HEX-ACACAGACCTCCGATACACAGC-BHQ1。

2.權(quán)利要求1所述的特異性引物和探針組合在制備豬流行性腹 瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒雙重微滴數(shù)字PCR絕對定量檢測試劑 盒中試劑的應(yīng)用。

3.一種含有權(quán)利要求1所述特異性引物和探針組合的試劑盒。

4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其為雙重微滴數(shù)字PCR絕對定 量檢測試劑盒。

5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含病毒總RNA 萃取試劑和一步法微滴數(shù)字PCR檢測試劑；所述一步法微滴數(shù)字PCR 檢測試劑包括無RNA酶的蒸餾水，一步法ddPCR探針法預(yù)混液，探針 法ddPCR微滴發(fā)生油，質(zhì)控液，陰性對照和陽性對照。

6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性對照為豬 流行性腹瀉病毒和豬傳染性胃腸炎病毒RNA混合液，陰性對照為無 RNA酶蒸餾水。

7.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，所述一步法ddPCR 探針法預(yù)混液其900μL的配方為：500μL的2XOne-stepRT-ddPCR Supermix，PEDV上、下游引物分別為90μL，TGEV上、下游引物分 別為90μL，PEDV和TGEV的特異探針分別為20μL，引物和探針的濃 度均為10μM。

8.如權(quán)利要求4-7任一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒 的工作程序?yàn)椋?

(1)配制ddPCR反應(yīng)液；ddPCR反應(yīng)液20μL配方為：一步法 ddPCR探針法預(yù)混液18μL，待測樣品RNA模板為2μL；

(2)制備微滴，然后將微滴轉(zhuǎn)入PCR板，于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)將完成PCR擴(kuò)增的PCR板放入微滴分析儀中，檢測微滴， 分析數(shù)據(jù)，顯示檢測結(jié)果。

9.如權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，步驟(2)中PCR 的擴(kuò)增程序?yàn)?0℃反轉(zhuǎn)錄10min；95℃預(yù)變性10min；94℃變性30 sec，54～56℃退火60sec，共40個循環(huán)；98℃10min結(jié)束反應(yīng)，每步 都設(shè)置2.5℃/sec的降溫速度。

10.權(quán)利要求3-9任一所述的試劑盒在豬疫病檢測和預(yù)防中的應(yīng) 用。