[發(fā)明專利]對(duì)橙色粘球菌JCH-04次級(jí)代謝產(chǎn)物分離純化提取抗霉枯草菌素的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610057944.1
• 申請(qǐng)日: 2016-01-28
• 公開（公告）號(hào): CN105648001A
• 公開（公告）日: 2016-06-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 賈建波;劉軒豪;李東
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 淮陰工學(xué)院
• 主分類號(hào): C12P21/04
• 分類號(hào): C12P21/04;C07K7/64;C07K1/16;C07K1/14;C12R1/01
• 代理公司: 淮安市科翔專利商標(biāo)事務(wù)所 32110
• 代理人: 韓曉斌

1.對(duì)橙色粘球菌JCH-04的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化提取抗霉枯草菌素的方法，該橙 色粘球菌JCH-04（MyxococcusfulvusJCH-04）在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微 生物中心保藏，保藏編號(hào)為：CGMCCNo.2893；其特征是：取一環(huán)菌種接種于裝有25mL種子培 養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)2天得種子液；將種子液以體積比1:10接種于含有 100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液；將1000mL發(fā)酵液用60 目篩過濾，收集樹脂，裝入層析柱中，用質(zhì)量濃度20%甲醇沖洗，再用純甲醇洗脫，收集洗脫 液，50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得粗提物1.9631g；粗提物中分別加入50mL的水和乙酸乙酯，混勻后 離心，吸取水相，冷凍干燥得凍干粉563.5mg；凍干粉用3mL純甲醇溶解，離心，取上清液通過 SephadexLH-20凝膠層析分離，流速0.6mL/min，收集140~180min的餾分；將餾分于50℃旋 蒸濃縮至2mL，通過半制備色譜分離，收集保留時(shí)間為39.159min和42.919min的組分，分 別為C14Mycosubtilin和C15Mycosubtilin。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)橙色粘球菌JCH-04的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是該方法具體步驟是：

（1）種子液培養(yǎng)：取上一環(huán)保藏編號(hào)為CGMCCNo.2893的橙色粘球菌JCH-04的菌種接種 于裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)2天，得種子液；其中，1000mL種子培養(yǎng)基配 方為：10g土豆淀粉，2g葡萄糖，2g安琪酵母，4g脫脂奶粉，1g氯化鈣，1g硫酸鎂，8mg乙二胺四 乙酸鐵鈉鹽，用去離子水定容至1000mL，pH為7.2；

（2）發(fā)酵培養(yǎng)：將上述種子液以體積比1:10接種于含有100mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角 瓶中，30℃180rpm培養(yǎng)6天，得發(fā)酵液；其中1000mL發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：10g土豆淀粉，2g葡 萄糖，2g安琪酵母，4g脫脂奶粉，1g氯化鈣，1g硫酸鎂，8mg乙二胺四乙酸鐵鈉鹽，5g甘油，20g XAD-16大孔吸附樹脂，用去離子水定容至1000mL，pH為7.2；

（3）提取粗產(chǎn)物：將上述1000mL發(fā)酵液用60目篩過濾，收集樹脂，先用水洗去樹脂表面 殘留的發(fā)酵液，然后將樹脂裝入玻璃層析柱中，層析柱規(guī)格2×50cm，用100mL質(zhì)量濃度20% 甲醇以1mL/min的流速流過樹脂柱清洗樹脂，再用純甲醇以1mL/min的流速洗脫樹脂，收集 甲醇洗脫液200mL，將200mL甲醇洗脫液于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮得油脂狀粗提物，稱重 1.9631g；

（4）萃取：粗提物1.9631g中分別加入50mL乙酸乙酯和50mL水，溶解粗提物，10000rpm離 心3min，乙酸乙酯相和水相分層，用移液器吸取水相，將水相冷凍干燥得凍干粉，稱重 563.5mg；

（5）SephadexLH-20凝膠層析：用3mL純甲醇溶解凍干粉563.5mg，離心取上清液，通過 SephadexLH-20凝膠層析分離，凝膠層析柱規(guī)格為2×50cm，SephadexLH-20凝膠量為20g， 洗脫劑為純甲醇，流速0.6mL/min，收集140~180min的餾分；

（6）半制備色譜分離：將上述餾分于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2mL，再采用半制備色譜分離 純化，制備柱為C18柱（HederaODS-2，5μm，10.0×250mm），檢測(cè)波長(zhǎng)215nm，進(jìn)樣量2mL，收 集保留時(shí)間為39.159min和42.919min的組分，于50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙腈后，冷凍干燥，分 別得C14Mycosubtilin31.4mg和C15Mycosubtilin28.6mg。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的對(duì)橙色粘球菌JCH-04的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化提取抗霉 枯草菌素的方法，其特征是：C14Mycosubtilin的分子式為C₄₈H₇₄O₁₄N₁₂,C15 Mycosubtilin的分子式為C₄₉H₇₆O₁₄N₁₂;C14Mycosubtilin分子結(jié)構(gòu)式為：

，

C15Mycosubtilin為其同系物，在脂肪酸直碳鏈上多一個(gè)亞甲基(-CH₂)。