[發明專利]一種拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花的制備方法及應用

在審

• 申請號: 201610054030.X
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105602926A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 尹小英;乾康;金晨;劉慶山;程林;張媛媛;高淑婷
• 申請（專利權）人: 尹小英
• 主分類號: C12N9/96
• 分類號: C12N9/96;C12N9/90;A61K36/185;A61P35/00
• 代理公司: 廈門市精誠新創知識產權代理有限公司 35218
• 代理人: 方惠春

1.一種拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花的制備方法，其特征在于，具體制備步驟如下：

（1）用超純水溶解CuSO₄，配成濃度為115～125mmoL/L的CuSO₄溶液；

（2）配置PBS緩沖液使其pH值為7.4，將20mL的上述CuSO4溶液加到3L的拓樸異構酶Ⅱ-PBS緩沖液，在24～26℃下反應3天，將反應產物用超純水反復超聲5～8次，沖洗4～6次，冷凍干燥得固體粉末，即得拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花。

2.一種如權利要求1所述的拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花的應用，其特征在于，該拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花用于分離多穗金粟蘭中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分的提取，其具體提取步驟如下：

（1）多穗金粟蘭粗提液的制備

取多穗金粟蘭粗粉18～22g，置于500mL圓底燒瓶，加240～260mL體積分數為95%的乙醇，加熱回流提取55～65min，重復提取2～3次，濾過，濃縮，回收乙醇得到浸膏，少量水稀釋后，用等體積的石油醚、氯仿依次萃取，用旋轉蒸發儀減壓回收有機溶劑，得到氯仿部位提取液，備用；

（2）固相萃取柱分離多穗金粟蘭氯仿提液中的拓樸異構酶抑制有效成分

將上述得到的拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花采用干法裝柱填充到固相萃取柱中，并用色譜純甲醇平衡柱子；取多穗金粟蘭氯仿提取液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液濃縮、干燥，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構；

（3）微型固相吸頭萃取小柱分離多穗金粟蘭粗提液中的拓樸異構酶抑制有效成分

將上述得到的拓樸異構酶Ⅱ雜化納米花填充到Tip吸頭柱并固定，配合單道移液器，作為吸頭小柱微萃取裝置；先用色譜純甲醇活化萃取材料，再用體積分數為20%甲醇溶液平衡吸頭材料；吸入多穗金粟蘭粗提液上樣，用體積分數為20%的甲醇溶液淋洗，再用甲醇洗脫，洗脫液氮氣吹干，即得多穗金粟蘭氯仿提取液中拓樸異構酶抑制作用的抗腫瘤有效成分，結合LC/MS分析確定有效成分的結構。