[發(fā)明專利]一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610053312.8
• 申請日: 2016-01-27
• 公開（公告）號: CN105567725A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 余麗蕓;侯喜林
• 申請（專利權(quán)）人: 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
• 主分類號: C12N15/74
• 分類號: C12N15/74
• 代理公司: 北京國智京通知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法。

背景技術(shù)

乳桿菌在農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域具有重大的經(jīng)濟意義以及對動物和人體健康公認的重要性,越來越引起人們 的關(guān)注。幾個世紀以來,乳桿菌作為重要的益生菌已廣泛地應(yīng)用于食品及飲料加工業(yè),其生物學(xué)特性為棒狀, 厭氧或微需氧,屬易生菌。以乳桿菌作為發(fā)酵菌的食品工業(yè)所創(chuàng)造出的經(jīng)濟價值占全球總的發(fā)酵類食品的 20％。同時乳桿菌也被廣泛用于腸、肉類食品的加工和保鮮。乳桿菌通過重建腸道菌群平衡,從而有利于 人類及某些動物宿主恢復(fù)并提高健康狀態(tài)。

由于乳桿菌廣泛的工業(yè)用途和在醫(yī)學(xué)上的重要意義，對乳桿菌分子遺傳學(xué)研究成為焦點，特別是利用 基因工程技術(shù)，以乳桿菌為載體攜帶外源基因(如抗原、酶、小肽分子等)到人和動物體內(nèi)直接產(chǎn)生外源 蛋白質(zhì)。乳桿菌的遺傳操作的先決條件是建立方便和可靠的轉(zhuǎn)化方法。目前乳桿菌的轉(zhuǎn)化方法有原生質(zhì)體 轉(zhuǎn)化法和電擊轉(zhuǎn)化法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法最早出現(xiàn)，但具有繁瑣、耗時和不穩(wěn)定的缺點而被摒棄，一種干酪 乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法取代了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，但是仍然不十分完善，尤其是重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，以克服傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低的問題。

為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，達到上述技術(shù)效果，本發(fā)明公開了一種干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，方法包括了干 酪乳桿菌培養(yǎng)、干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng)，具體步驟為：

干酪乳桿菌培養(yǎng)：

A.從低溫冷凍冰箱取出一支加入甘油保存的干酪乳桿菌菌種，在MRS固體培養(yǎng)基上劃線，37℃厭氧倒 置培養(yǎng)；

B.用無菌的接菌環(huán)挑取在MRS上生長好的菌落至試管里MRS液體培養(yǎng)基中，37℃靜止培養(yǎng)過夜；

C.第二日將前一天生長好的菌液1mL轉(zhuǎn)接到50mLMRS液體里，37℃靜止生長至菌液600nm處紫外吸 收值為0.5-0.6時，準(zhǔn)備干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化；

干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化:

D.將干酪乳桿菌移入50mL離心管里，放到冰盒里靜置20分鐘后，放到提前預(yù)冷到4℃離心機中 5000r/min，5分鐘，棄掉上清，留下沉淀；向沉淀里移入40mLEPWB溶液，使沉淀懸浮于EPWB溶液中， 放到提前預(yù)冷到4℃的離心機中5000r/min，5分鐘，棄掉水相，留下菌體，此步驟重復(fù)3次，用40mLEPB 溶液洗滌菌體一次，棄上清；

E.菌體用400μL的EPB溶液重懸，分裝500-300μL/支(現(xiàn)用現(xiàn)配)，用于電轉(zhuǎn)；

F.質(zhì)粒DNA1μg加入到之前制備好的干酪乳桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混合，冰浴10分鐘；

G.將質(zhì)粒與干酪乳桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)入提前預(yù)冷的2mm電擊杯中，冰浴10分鐘；

H.用濾紙將電轉(zhuǎn)化杯表面擦干，放入電轉(zhuǎn)儀中，調(diào)節(jié)電壓2.3kV、電阻200Ω、電容25μF，脈沖時間 約為4-5ms；

I.向電擊杯中快速加入900μL的含有0.5％甘氨酸的MRS，輕輕地用移液器吹吸混合后移到一個無菌 的Eppendorf管中，放到提前調(diào)至37℃的80-100rpm/min搖床內(nèi)孵育1.5-3小時；

轉(zhuǎn)化后再培養(yǎng):

J.孵育后的混合液離心，留下100μL上清，重新懸浮；然后涂布于含有選擇壓力的MRS瓊脂平板上， 37℃無氧倒置培養(yǎng)24-36小時。

其中，MRS培養(yǎng)基為莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基，EPWB溶液為：NaH₂PO₄0.6mmol/L和MgCl₂0.1mmol/L 配置而成，EPB溶液為EPWB溶液基礎(chǔ)上加入0.3mol/L蔗糖，調(diào)節(jié)pH為7.4，并滅菌4℃保存。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1.本發(fā)明公開了干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化的具體方法和步驟，克服了傳統(tǒng)電轉(zhuǎn)化重復(fù)性不好，轉(zhuǎn)化率低的問題。 2.經(jīng)過合理優(yōu)化的干酪乳桿菌電轉(zhuǎn)化方法，可以應(yīng)用于多種不同外源DNA表達，潛在的推動了生物藥物基 因的高效表達。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說 明。

實施例1