[發明專利]用于檢測黃曲霉毒素的單克隆抗體及酶聯免疫方法與試劑盒

有效

• 申請號: 201610051042.7
• 申請日: 2016-01-26
• 公開（公告）號: CN105524168B
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: 袁宗輝;陶燕飛;彭大鵬;楊碧嘉;王玉蓮;潘源虎;陳冬梅
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C07K16/14
• 分類號: C07K16/14;C12N5/20;G01N33/577;C12R1/91
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 徐紹新

本發明公開了一種能識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的特異性單克隆抗體,它是由雜交瘤細胞株AFB1/3B9所分泌的，所述的雜交瘤細胞株AFB1/3B9，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC NO:C201558。本發明還公開了檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶聯免疫方法和試劑盒。與現有技術相比，本發明制備的單克隆抗體可以同時識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2四種毒素，而且具有很高的識別靈敏度，本發明的酶聯免疫方法和試劑盒具有簡便、快速、靈敏、準確等優點。

技術領域

本發明屬于獸藥殘留分析和免疫學技術領域，具體涉及一種能識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的單克隆抗體和一種用于檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶聯免疫方法(ELISA)及試劑盒。

背景技術

黃曲霉毒素主要是由黃曲霉和寄生曲霉分泌的次級代謝產物，是一類結構相似的化合物，都含有二呋喃環和香豆素，其有20多種，目前分離鑒定的有12種，常見的主要為黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2。黃曲霉毒素主要污染農作物和飼料。使用了污染黃曲霉毒素的飼料，可引起豬只產死胎和木乃伊胎，并可引起雞產蛋率下降和口腔潰瘍。經研究發現，黃曲霉毒素具有明顯的“三致”作用，人誤食了污染了黃曲霉毒素的食物會引起中毒，甚至死亡。

目前檢測黃曲霉毒素的方法主要為儀器方法和免疫學方法。儀器方法雖然靈敏、準確、分離度高并且可進行多殘留檢測的定性、定量研究，但是需要昂貴的儀器、繁瑣的前處理、熟練的專業操作員。如果采用儀器分析法進行大批量樣品的檢測，其成本將非常高，而且在目前的國家檢測機構中大部分只有省市級才配備有精密的分析儀器。免疫化學分析法特別是酶聯免疫吸附分析技術具有快速、靈敏度高、操作簡單、適應性強等優點，適合高通量樣品篩選，因此對于快速檢測黃曲霉毒素的殘留，ELISA方法更具優勢。而制備較高靈敏度的抗體是ELISA方法的根本，只有制備出較高靈敏度的抗體，才能制備出具有競爭性的ELISA試劑盒。王雄等(2008)利用ELISA方法檢測飼料中的黃曲霉毒素B1，抗體的最低檢測限為0.05ng/mL，標準曲線的線性范圍為0.05～2.00ng/mL，其抗體靈敏度不高，且使用的樣品前處理過程較為復雜，不便于在基層使用；王磊等(2012)制備了抗黃曲霉毒素B1抗體，該抗體的IC50值為2.58ng/mL；李敏等(2015)采用異源包被的抗原建立了ELISA方法，其抗體靈敏度由1.6ng/mL提高到了0.3ng/mL，同時成功建立了ELISA方法。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種能識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的單克隆抗體，以提高識別的靈敏度和特異性；本發明的另一個目的是提供一種用于檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶聯免疫方法及試劑盒，以提高檢測的靈敏度、準確度和精密度，同時簡化操作程序。

上述目的是通過以下技術方案實現的：

一種能識別黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的單克隆抗體，它是由雜交瘤細胞株AFB1/3B9所分泌的。

所述的雜交瘤細胞株AFB1/3B9，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:C201558。

所述的單克隆抗體，它是以黃曲霉毒素B2(AFB2)與羧甲基羥胺半鹽酸鹽(CMO)反應生成黃曲霉毒素B2肟(AFB2O)，AFB2O再與載體蛋白偶聯得到的偶聯物作為免疫原制備得到的。本發明優選的免疫原載體蛋白是血藍蛋白(KLH)。

所述的單克隆抗體可用于建立檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法。

所述的單克隆抗體可用于制備檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的酶聯免疫試劑盒。

一種檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的ELISA方法，包括免疫原、包被原和抗體的制備，間接競爭ELISA方法的建立，其步驟如下：

(1)將AFB2與CMO反應得到的半抗原AFB2O；