[發明專利]has-miR-29b-3p的檢測

在審

• 申請號: 201610048023.9
• 申請日: 2016-01-25
• 公開（公告）號: CN105567826A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 杜鴻;王敏;張海方;謝小芳;李愛青;周惠琴
• 申請（專利權）人: 蘇州大學附屬第二醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司 32103
• 代理人: 范晴

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及快速檢測指標技術領域，特別涉及一種檢測 microRNAhas-miR-29b-3p的試劑盒及其方法。

背景技術

血流感染是感染性疾病最嚴重的臨床表現形式之一，患者發生血流感染，會導致 住院時間的延長以及住院費用的增加，且病死率高。血流感染的診斷傳統通過血培養來鑒 定，但具有需要的血樣量多和出報告的時間長等缺點。

人體的巨噬細胞具有通過識別、吞噬并最終清除細菌的作用，在宿主抵御病原菌 感染的過程中發揮巨大作用。has-miR-29b-3p是巨噬細胞在受到細菌感染時會高表達的一 種microRNA，并且在血培養陽性患者血清中可檢測到其較對照組升高。

發明內容

本發明的目的是提供檢測has-miR-29b-3p的試劑盒，建立一種檢測has-miR-29b- 3p的方法。該方法有快速、準確、方法簡單、成本低的優點，有利用臨床使用和推廣。

為了解決現有技術中的這些問題，本發明提供的技術方案如下：

一種檢測has-miR-29b-3p的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括用于特異性擴 增has-miR-29b-3p的特異性引物對，所述引物為具有SEQIDNo：1的連續核苷酸序列和具 有SEQIDNo：2的連續核苷酸序列；

所述試劑盒中還包括RNA逆轉錄引物，其序列為SEQIDNo：3。

SEQIDNo：1:5’GGGTAGCACCATTTGAAA3’

SEQIDNo：2:5’TGCGTGTCGTGGAGTC3'

SEQIDNo：3如下所示：

5’GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACAACACTG3’

優選的技術方案是：所述試劑盒還包括與引物序列構成PCR反應體系的Pfu緩沖 液、dNTPs、MgSO₄、PfuDNA聚合酶、模板DNA、熒光染料；所述PCR反應體系的終濃度組成為：

優選的技術方案是：所述熒光染料可選自DNA飽和性染料包括EvaGreen染料、PLUS染料、ResoLight染料、SYTO9染料、SYBRgreen染料；所述dNTP混合液包括10mMdATP、10mMdCTP、10mMdTTP、10mMdGTP的混合液。

本發明的第二方面是提供一種前述的試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)血清總RNA的提取：包括取血樣離心后，取上清，加入TRIzolLSReagent試劑 和冰醋酸，劇烈振蕩混勻進行勻漿；孵育后加入氯仿抽提，取水相加入異丙醇沉淀RNA，離心 沉淀RNA，去除上清液后加入乙醇清洗沉淀RNA，最后空氣干燥，加入無RNA酶的水溶解RNA備 用；

(2)逆轉錄：在SEQIDNo：3的反轉錄酶的作用下及RNA酶抑制劑存在的條件下反 應，反應條件16℃30min,42℃40min,85℃5min,最后在冰上待用或-20℃保存；

(3)熒光定量PCR(RT-PCR):使用SEQIDNo：1的引物和SEQIDNo：2的引物進行熒 光定量PCR反應，

(4)建立標準曲線，按絕對定量方法對結果進行分析。

在本發明中，術語“試劑盒”是指用于PCR反應的混合物，它包括反應所需的緩沖液 (buffer)、dNTP混合液、引物、熒光染料、MgCl₂、PfuDNA聚合酶。

在本發明中，術語“引物”是指一種寡核苷酸，可以是天然的也可以是合成，它可以 作為在一定條件下誘發DNA合成的起始點，在上述條件下可以誘發合成與核酸鏈相互補的 引物擴增產物，即在四種不同的三磷酸脫氧核糖核酸及一種聚合試劑(即DNA聚合酶或逆轉 錄酶)存在下，在一種合適的緩沖液并在合適的溫度下進行上述合成。優選的引物是單股寡 脫氧核糖核苷酸。引物的合適長度取決于該引物的設計用途，但在一般在15～25個核苷酸 之間，較短的引物分子通常需要較低的溫度，從而與模板形成充分穩定的雜交復合物。引物 不必反應模板的準確序列，但必須充分互補，已與模板雜交并引發DNA合成。

本發明的采用實時熒光定量PCR檢測患者血清標本中has-miR-29b-3p表達水平， 從而快速篩查血流細菌感染患者。

本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：