[發明專利]一種基因重組人C肽融合蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201610045691.6
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105601750B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 鄒炳德;鄒繼華;李富勇;祝快昌
• 申請（專利權）人: 美康生物科技股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;C07K16/26;C07K16/06;G01N33/68;C12R1/84
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務所(普通合伙) 33228
• 代理人: 沈春紅

一種基因重組人C肽融合蛋白及其制備方法與應用：該融合蛋白是淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒S片段從167至224氨基酸片段的58個氨基酸即LCMVs(167?224)與人C肽的全序列31個氨基酸串聯形成的融合蛋白；LCMVs(167?224)在融合蛋白的N端，人C肽的全序列在融合蛋白的C端；LCMVs(167?224)氨基酸序列為SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，人C肽的氨基酸序列為SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。該融合蛋白比偶聯BSA或KLH刺激小鼠的免疫反應能力更強，免疫小鼠獲得的抗血清對于C肽效價更高，更容易制備出高親和力的C肽抗體用于免疫學檢測，在抗體制備和免疫學檢測等領域將有良好的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種基因重組人C肽融合蛋白(C肽融合蛋白)，具體為一種基因重組人C肽融合蛋白即LCMVs(167-224)-C肽及其制備方法與應用，屬于基因工程技術、抗體制備、免疫檢測等領域。

背景技術

C肽(人C肽)是指胰島素原(由86個氨基酸組成，分子量9000道爾頓，它的結構是由胰島素及連接肽兩部分組成，連接肽有35個氨基酸組成)隨細胞漿中的微泡進入高爾基體，它在胰島素原轉化酶作用于分解時，與胰島素的AB兩鏈相接的CA1賴氨酸、CA2精氨酸、Bc1精氨酸及Bc2精氨酸等四個氨基酸分離形成的31個氨基酸的多肽。

正常人24h尿中排出C肽為36±4μg。幼年型糖尿病者為1.1±0.5μg；成年型糖尿病者為24±7μg。C肽清除率與肌酐清除率無明顯關系。C肽的清除濾較胰島素微高。C肽為5.1±0.6mL/min，后者為1.1±0.2mL/min。每日C肽排出量相當于胰島分泌量的5％，占胰島素總量的0.1％，因此C肽的測定可應用于臨床。C肽具有如下特點：(1)在胰島的β細胞的分泌中，胰島素與C肽總分子量相等。(2)胰島素半衰期為4.8min，而C肽為11min，胰島素原為17.5min。(3)胰島素在肝腎內分解而C肽不被分解是完整鏈從腎臟排出。(4)C肽無生物學活性，但具有很強的種屬特異性，與抗胰島素無交叉免疫反應。由于胰島素原的濃度還不到C肽的十分之一，故一般檢測C肽(總C肽)可代表血中的游離C肽。

C肽測定具有重要的臨床意義：(1)可反映機體胰島β細胞的分泌功能；(2)C肽測定對糖尿病患者的分型和低血糖癥的鑒別有指導意義；(3)測定C肽濃度可作為鑒定胰臟手術后的療效和殘存β細胞分泌功能的一項定量指標，以確定是否給與胰島素。在隨訪中多次測定C肽濃度，也有利于判定腫瘤有無復發或轉移。

直接免疫C肽無法獲得抗C肽特異性抗體，加入一般的載體蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、血藍蛋白(KLH)同樣很難免疫得到高親和力的特異性抗體。對于一些特殊的半抗原，選擇合適的載體蛋白成為了制備其優良抗體的關鍵。

LCMV(淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒)能感染人和許多種動物，使其患淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎(Lymphocytic Choriomeningitis，LCM)。LCM為人畜共患病，小鼠、豚鼠、倉鼠、犬、猴、雞、兔和棉鼠均易感。LCMV病毒是非溶細胞性病毒，在動物體內增殖并不對機體產生損害，而是動物本身對病毒的免疫反應，導致對機體的損害而表現出臨床癥狀。急性感染的小鼠由于不同的組織和病毒數量而產生不同程度的免疫反應，反應強烈的可引起動物死亡。該病毒能在體內引起強烈反應的主要片段是LCMVs。

通過選擇優勢抗原片段中的抗原表位區域所編碼的基因序列，截取LCMVs中優勢抗原區域作為C肽的載體，通過基因工程和層析技術，獲得優良的完全抗原。C肽作為半抗原，只有抗原性，沒有免疫原性，很難引起動物的免疫反應，與LCMVs優勢抗原區域偶聯后，獲得的完全抗原能夠免疫動物產生高效價的抗體，是制備C肽抗體的必要條件。

發明內容