[發明專利]一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201610045667.2
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105603122A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 劉代新;陳靜;何勝祥;劉軍輝
• 申請（專利權）人: 上海同科生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 杜蔚瓊

技術領域

本發明涉及一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，屬于基因檢測領域。

背景技術

我國2006年乙型肝炎流行病學調查表明，我國1-59歲一般人群HBsAg攜帶率為 7.18％，5歲以下兒童的HBsAg僅為0.96％。據此推算，我國現有的慢性乙型肝炎病毒感染者 約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例。2013年乙型肝炎新增962,974例，占同年 病毒性肝炎的76.92％；死亡病例達550例，占同期病毒性肝炎死亡人數的74.42％。乙肝不 僅嚴重影響人民身體健康，而且還造成了重大經濟損失。據統計，我國每年因乙肝所致的直 接經濟損失約300億～500億元。同時，由于我國的乙肝患者年齡大多在20～50歲之間，是社 會的中堅力量。因此，乙肝的預防與治療具有重大的社會意義。隨著社會進步和人民生活水 平的提高，我國政府對乙肝的預防與治療日益重視，醫療保障體系覆蓋率不斷擴大，乙肝知 曉率和就診率不斷提高，乙肝用藥市場保持了快速增長的勢頭。在各類乙肝用藥中，抗病毒 類藥物市場份額較大，且增長較快。2011～2013年，我國抗病毒類乙肝用藥保持著19.90％ 的復合增長率，2013年市場規模達到132.24億元。在我國乙肝抗病毒用藥市場中，阿德福韋 酯、恩替卡韋、拉米夫定等主要藥品占有70％左右的市場份額。其中拉米夫定仍是銷量較大 的一線用藥，市場保有量很大。

通過抗病毒藥物的運用，乙型肝炎病毒已得到有效治療。但是，長期單一治療通常 不能完全抑制病毒的復制，而會出現耐藥突變，拉米夫定耐藥是抗病毒藥物中最常見發生 的耐藥突變藥物。這種耐藥突變主要是YMDD基序上的蛋氨酸(M)被異亮氨酸(I)和纈氨酸 (V)替代的結果。當乙型肝炎病毒的YMDD突變為YIDD(204I)或YVDD(204V)時，就會發生拉米 夫定耐藥。并隨治療時間延長而突變率逐漸增高，一般治療1年的變異率為24％，2年約 38％，治療3年后變異的發生率49％。而阿德福韋酯、恩替卡韋治療3年后得變異分別只占到 11％和1.2％。耐藥一旦發生，將極大降低乙型肝炎病毒對拉米夫定的敏感性，治療效果顯 著下降，抗病毒療效將降低。乙型肝炎病毒的DNA會重新回升，部分患者會出現肝炎急性發 作，甚至肝功能失常因此。因此，通過檢測YMDD的突變判斷乙型肝炎病毒對拉米夫定的敏感 性，在指導患者臨床用藥，監控患者抗病毒療效方面有重大意義。準確、簡便的拉米夫定耐 藥株檢測對慢性乙型肝炎病人的療程管理十分必要，能為臨床用藥能提供有力的證據。

目前，對乙型肝炎病毒YMDD變異株的基因診斷方法中主要有DNA測序法，PCR- RFLP、聚合酶鏈反應-酶聯免疫吸附法(PCR-ELISA)，基因芯片技術、熔解曲線分析法和實時 熒光定量PCR。其中DNA測序法是檢測YMDD變異株的金標準，但其操作麻煩，耗時過長。PCR- RFLP和聚合酶鏈反應-酶聯免疫吸附法(PCR-ELISA)雖然能較好的鑒別野生株和變異株，但 易產生污染而引起假陽性，另相對于熒光探針分析，在靈敏度及特異性上都有一定差異。基 因芯片技術具有高通量、快速、高靈敏等優勢但其檢測需要昂貴的儀器，專業的配套人員， 高昂的價格限制了臨床診斷應用。熔解曲線分析法具有快速、方便、經濟的特點，但此該法 的敏感度和特異性不高。

發明內容

本發明的目的在于提

本發明采用了如下技術方案：

本發明提供一種乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，其特征在于，包括：DNA 提取試劑，PCR反應預混液，熱啟動Taq酶、UDG酶，陽性質控品，以及陰性質控品，其中，所述 PCR反應預混液中具有上游引物：5′-CCGTTTCTCCTGGCTCAGTTTACTAG-3′，以及下游引物：5′- GGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGG-3′。

進一步，本發明的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，還可以具有這樣的特 征：其中，所述DNA提取試劑成分為：莎梵婷，CTAB，乙醇，氯化鉀。

進一步，本發明的乙型肝炎病毒YMDD基因突變檢測試劑盒，還可以具有這樣的特 征：其中，所述PCR反應預混液中具有第一探針：5′- CCCCAATACCACATCATCAATATAACTGAAAGCCAGACAG-3′，其中5′標記FAM基團，3′標記TAMARA基 團。