[發明專利]一種檢測APOE基因多態性的引物及其方法

在審

• 申請號: 201610043844.3
• 申請日: 2016-01-22
• 公開（公告）號: CN105525002A
• 公開（公告）日: 2016-04-27
• 發明（設計）人: 胡昌明;燕啟江;梁耀銘;于世輝;趙薇薇;郭周萍
• 申請（專利權）人: 廣州金域檢測科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京精金石專利代理事務所(普通合伙) 11470
• 代理人: 劉曄

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種檢測APOE基因多態性的引物及其方 法。

背景技術

載脂蛋白E(apolipoproteinE,ApoE)是血漿中重要的載脂蛋白之一，其基因定位 于第19對染色體長臂上，長37kb，其包含4個外顯子和3個內含子。ApoE有三種構體 （isoform）即E2、E3和E4。ApoE的氨基酸序列的112位和158位兩種氨基酸殘基即精氨酸 （Arg）和半胱氨酸（Cys）的交換決定了異構體的種類。ApoE4在這兩個位置上都是Arg；E2都 是Cys；112位為Cys和158位是Arg者為ApoE3異構體，在自然人群中，基因頻率E3分布最高， ApoE3/3表型分布約70%。人群中可有六種不同的表型：三種純合子（E2/2，E3/3，E4/4）和三 種雜合子（E2/3，E2/4，E3/4）。

ApoE主要在肝臟合成、分泌和代謝，參與脂質的運輸、儲存及排泄，有修復組織、抑 制血小板聚集、免疫調節等作用。李冬梅等發表了一篇題目為“APOE基因多態性與阿爾茨海 默病的相關性研究”的論文，該論文表明APOEε4等位基因，HDL-C與散發性AD有關聯，APOEε4 可能是散發性AD發病的危險因素，并建議把APOEε4和HDL-C等作為散發性AD的生物標記。現 代研究發現，ApoE基因多態性還與冠心病(coronaryheartdisease,CHD)、高脂血癥、腦梗 塞、Alzheimer病(AD)和慢性乙型肝炎等疾病有著密切的關系。因此，研究和開發出檢測 ApoE基因多態性的方法或試劑盒對臨床具有重大的意義。

中國專利申請201110446186.X公開了APOE基因檢測試劑盒及擴增方法和檢測方 法，所述試劑盒包括檢測基因APOErs429358位點和rs7412位點的引物及內參引物，所述檢 測APOE基因rs429358位點的引物包括正向野生型引物和正向突變型引物；所述檢測APOE 基因rs7412位點的引物包括正向野生型引物和正向突變型引物；所述APOE基因內參引物 包括正向內參引物和反向共用引物。所述APOE基因檢測試劑盒是對受檢樣本DNA分別用野 生型和突變擴增緩沖液進行擴增，在每個反擴增反應中同時對2個目的片段和1個內參片段 進行擴增，擴增后經凝膠電泳在紫外光下見到根據片段大小區分開的產物條帶，根據條帶 的有無判斷2個SNP位點的基因型。

中國專利申請201510288426.6公開了檢測ApoE基因多態性的引物、試劑盒及其 PCR方法，所述檢測ApoE基因多態性的引物包括檢測rs429358位點和rs7412位點的兩組引 物。該檢測試劑盒能夠大大增加等位基因特異性引物PCR區分不同等位基因位點的能力，使 不同位點間的非特異性交叉擴增的可能性降到最低，能夠做到真正“全或無”式的擴增，不 僅有很好的特異性，也具有非常好的靈敏度，能檢出1ng基因組DNA中的基因型分布情況。

然而，上述的ApoE基因多態性的檢測引物較復雜，而且檢測步驟較繁瑣，不利于該 檢測方法的推廣和利用。因此，研究和發開出檢測方法簡單，操作便捷，引物特異性高，檢測 結果精確度高的ApoE基因多態性的檢測方法仍是目前研究的重點。

發明內容

為了解決現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種檢測APOE基因多態性的引物及 其方法，該引物主要用于檢測APOE基因中APOE_T112Ch和APOE_C158T的兩個位點，具有特 異性好、靈敏度高、準確性好等優點，為APOE基因多態性提供了一種簡單有效的檢測方法。

本發明提供了一種檢測APOE基因多態性的引物，包括PCR擴增引物和SNaPshot PCR引物；所述PCR擴增引物為：針對APOE的上游引物5’-GCCTACAAATCGGAACTGGA-3’（SEQ IDNO.1）和下游引物5’-ACCTGCTCCTTCACCTCGT-3’（SEQIDNO.2）；所述SNaPshotPCR引 物包括：針對APOE_T112C的SNaPshotPCR引物5’-GCGCGGACATGGAGGACGTG-3’（SEQID NO.3）；針對APOE_C158T的SNaPshotPCR引物5’- TTTTTTTTTTTTTTTTTTGCGATGCCGATGACCTGCAGAAG-3’（SEQIDNO.4）。

進一步地，所述SNaPshotPCR引物中APOE_T112C與APOE_C158的引物濃度比為1: 1。