[發(fā)明專利]一種高效誘導(dǎo)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610038247.1
• 申請(qǐng)日: 2016-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105684898B
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-01-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張新華;馬國(guó)華;牛美云;吳坤林;曾宋君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院華南植物園
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于植物繁殖領(lǐng)域，具體涉及一種高效誘導(dǎo)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法。

背景技術(shù)：

檀香(Santalum album L.)為檀香科(Santalaceae)檀香屬(Santalum)半寄生常綠喬木，為名貴、珍稀植物，主要分布于印度，印度尼西亞，澳大利亞及太平洋的一些群島。人類利用它已有數(shù)千年的歷史，因其木材可用于雕刻和提煉檀香油而格外出名，素有“綠色黃金”之稱。中國(guó)無(wú)檀香的原生分布，其成品或半成品過(guò)去一直從國(guó)外進(jìn)口。1962年中國(guó)科學(xué)院華南植物園在大陸首次從印尼引入檀香種子繁育成功，其后從印度引入“老山香”優(yōu)質(zhì)種源也獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的研究試驗(yàn)，如今檀香在華南植物園已能結(jié)籽繁殖并能結(jié)香。近二十年來(lái)，我們研究組還向國(guó)內(nèi)其它地區(qū)推廣試種檀香。

研究資料表明：在斐濟(jì)，檀香和斐濟(jì)檀香的有性雜交種F1代(雜種檀香S.album×S.yasi)表現(xiàn)出明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，其生長(zhǎng)勢(shì)比母本斐濟(jì)檀香高300％，比父本檀香則高32％；結(jié)香方面，檀香需要10年，而雜種檀香則需要6-7年；在心材生長(zhǎng)方面，一般每株檀香需要種植25-30年心材達(dá)到40-80公斤，而雜種檀香F1只需種植15-20年。近年來(lái)我們加強(qiáng)與國(guó)內(nèi)外交流的基礎(chǔ)上，與廣東肇慶高要龍竹島檀香研究基地研究人員從國(guó)外引種雜種檀香到龍竹島檀香研究基地，生長(zhǎng)良好；雖然雜種檀香能夠少量結(jié)實(shí)，但后代性狀嚴(yán)重分離，必須尋求無(wú)性繁育技術(shù)以維持雜種優(yōu)勢(shì)。

目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生報(bào)道和專利申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種操作性強(qiáng)，繁殖效率和應(yīng)用價(jià)值高，能為雜種檀香大規(guī)?？焖俜敝程峁┓N苗的高效誘導(dǎo)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法

本發(fā)明采用雜種檀香嫩莖為外植體，進(jìn)行體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、萌發(fā)、成熟、再生植株，通過(guò)胚性愈傷誘導(dǎo)體細(xì)胞胚可獲得數(shù)量多，繁殖快，穩(wěn)定性高等特點(diǎn)?？蔀槌晒Φ亻_(kāi)展雜種檀香種苗快速繁殖提供育苗技術(shù)并為轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)提供一種有效的轉(zhuǎn)化途徑，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

本發(fā)明的高效誘導(dǎo)雜種檀香體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生的方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、胚性愈傷組織的誘導(dǎo)與增殖：以雜種檀香的幼嫩莖作為外植體，進(jìn)行消毒，將消毒后的外植體接種至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，獲得胚性細(xì)胞，每2星期轉(zhuǎn)接1次，可維持胚性愈傷的再生能力，所述的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升含有2,4-D(2，4－二氯苯氧乙酸)0.5-1.0mg、蔗糖20-30g、瓊脂6-7g，余量為MS培養(yǎng)基，所述的雜種檀香是父本檀香(Santalum album)和母本斐濟(jì)檀香(Santalum yasi)的有性雜交種F1代；

b、體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)與成熟：將胚性細(xì)胞轉(zhuǎn)接到體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生，獲得體細(xì)胞胚，挑選體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得成熟的子葉胚，所述的體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)培養(yǎng)基每升含有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0.2-0.5mg、蔗糖20-30g、瓊脂6-7g，余量為MS培養(yǎng)基，所述的體細(xì)胞胚成熟培養(yǎng)基每升含有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0.05-0.1mg、蔗糖20-30g、瓊脂6-7g，余量為MS培養(yǎng)基；

c、體細(xì)胞胚萌發(fā)與植株再生：挑取成熟的子葉胚轉(zhuǎn)入體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，獲得萌發(fā)的體細(xì)胞胚，將萌發(fā)的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移到植株再生培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得完整的再生植株，所述的體細(xì)胞胚萌發(fā)培養(yǎng)基每升含有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0.2-0.5mg、GA₃(赤霉素)0.5-1mg、蔗糖20-30g、瓊脂6-7g，余量為MS培養(yǎng)基，所述的植株再生培養(yǎng)基每升含有6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)0.2-1mg、IBA(吲哚丁酸)0.2-1mg、蔗糖20-30g、瓊脂6-7g，余量為1/2MS培養(yǎng)基。

所述的以雜種檀香的幼嫩莖作為外植體，進(jìn)行消毒，優(yōu)選是將外植體先用體積分?jǐn)?shù)50％的酒精水溶液擦拭外植體2-3次，然后在超凈工作臺(tái)上先用體積分?jǐn)?shù)75％酒精水溶液浸泡30秒，無(wú)菌水沖洗后放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1％HgC1溶液中浸泡5～6min，每隔2分鐘搖晃1次，無(wú)菌水沖洗2-3次，再用體積分?jǐn)?shù)6-12％過(guò)氧化氫溶液消毒6-8min，無(wú)菌水沖洗3-5次，獲得消毒后的外植體。

優(yōu)選，所述的步驟a的將消毒后的外植體接種至胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織，將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)接到新的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)；