[發明專利]一種快速檢測大腸桿菌O157：H7的方法

有效

• 申請號: 201610034284.5
• 申請日: 2016-01-19
• 公開（公告）號: CN105527428B
• 公開（公告）日: 2018-01-16
• 發明（設計）人: 賴衛華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558
• 代理公司: 南昌新天下專利商標代理有限公司36115
• 代理人: 施秀瑾

1.一種快速檢測大腸桿菌O157：H7的方法，其特征在于包括以下步驟：

1)納米微球的制備：

a.添加0.4-0.8mmolFeCl₃·6H₂O和0.2-1.6mmol FeCl₂·4H₂O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮氣并加熱到80-120℃，然后將3-7mL 25％的NH₃·H₂O添加到混合液中，反應2h；用永磁鐵從反應溶液中分離出黑色的固體物質用高純水清洗3～5次，得Fe₃O₄納米粒子；

b.取12mg Fe₃O₄納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH₄OH溶液，再將10-300μL正硅酸乙酯溶解在50μL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應12h，在Fe₃O₄納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復溶得到二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子；

c.把10-300μL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯釕(Ru(bqy)₃²⁺)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe₃O₄納米粒子，最后加入600-900μL的NH₄OH，劇烈攪拌3h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，用去離子水清洗備用；

d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復溶Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；

e.將硅烷化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球添加到包含0.06g NaHCO₃，0.08g十二烷基苯磺酸鈉，0.05mL苯乙烯，0.15mL丙烯酸和0.5g過硫酸鉀溶液的50mL的水溶液，水浴70℃，200r/min下攪拌，反應5h后得羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球；

2)取0.5-2mg羧基化的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球加入1mL偶聯緩沖液中，調節pH至5-10，加入0.05-0.18mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)活化羧基，及100-500μg抗大腸桿菌O157：H7單抗，在溫度37℃時，放在10-15rpm的旋轉儀上偶聯60-120min，磁分離3-5min，棄上清；用清洗緩沖液沖洗3-5遍之后，取1mL封閉劑與納米微球混合封閉0.5-1h，得到Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗；

所述偶聯緩沖液配制方法如下：將3mL 19.07g/mL的硼砂與7mL 12.37g/mL的硼酸混合后，稀釋10倍體積；

所述清洗緩沖液配制方法如下：稱取0.43g 2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)溶于200mL的無菌蒸餾水中，調pH為5.5-6.0；

所述封閉劑配制方法如下：取100mg牛血清白蛋白(BSA)加入1mL磷酸鹽(PBS)緩沖液配成封閉劑；

3)培養大腸桿菌O157：H7，將菌液調整濃度為10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL、10³CFU/mL，各取1mL備用；取待測樣品溶液1mL、各濃度菌液1mL，分別與100-150μg Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗，于溫度37℃，旋轉儀轉速10-15rpm混合孵育30-60min，孵育后磁分離3-5min后，棄上清，用PBS緩沖液清洗后，復溶于PBS中得Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗-菌；

4)免疫層析試紙條的制備：將樣本墊用含1％BSA，0.5％Tween-20的pH 8.50.1M Tris-HCl緩沖液浸泡處理，置于60℃鼓風干燥箱，2h后取出備用；將大腸桿菌O157：H7兔多抗和驢抗鼠二抗噴到硝酸纖維膜上分別作為檢測線(T線)和質控線(C線)，濃度均為1-2mg/mL，噴量均為0.75μL/cm，37℃真空干燥過夜，取出置于干燥缸中備用；將過濾墊、樣本墊、硝酸纖維膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，貼好后將其切成4mm寬的試紙條，裝卡；將制備好的試紙條裝入鋁箔袋中，加干燥劑密封，置于干燥缸中保存備用；

5)試紙條對樣品的檢測：將收集到的Fe₃O₄/Ru(bqy)₃²⁺納米微球-單抗-菌稀釋到50-150μg/mL，取100μL滴加到試紙條加樣孔中，10-15min后，用熒光讀取儀記錄T線、C線熒光強度和T/C的值；

6)定性分析：用肉眼觀察結果進行定性分析，T線顯色則說明樣品中有大腸桿菌O157：H7，T線不顯色則說明樣品中沒有大腸桿菌O157：H7或是含有大腸桿菌O157：H7的量低于10³CFU/mL；

7)定量分析：使用熒光讀取儀測量T線、C線的熒光強度，以及T/C值，以不同菌的濃度為橫坐標，T/C值為縱坐標繪制標準曲線，確定普通樣品中的大腸桿菌O157：H7數量。