[發(fā)明專利]一種快速檢測阪崎腸桿菌的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610034173.4 | 申請日： | 2016-01-19 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN105651991B | 公開（公告）日： | 2018-01-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 賴衛(wèi)華;王景云;劉道峰;鄧省亮;山珊;熊勇華;魏華 | 申請（專利權(quán)）人： | 南昌大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | G01N33/543 | 分類號(hào)： | G01N33/543;G01N33/569 |
| 代理公司： | 南昌新天下專利商標(biāo)代理有限公司36115 | 代理人： | 施秀瑾 |
| 地址： | 330031 江西省*** | 國省代碼： | 江西;36 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 快速 檢測 阪崎腸 桿菌 方法 | ||
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體采用Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球集成免疫磁珠捕獲技術(shù)和免疫層析快速檢測阪崎腸桿菌。
技術(shù)背景
阪崎腸桿菌是人和動(dòng)物腸道內(nèi)寄生的革蘭氏陰性無芽胞桿菌，為重要的食源性細(xì)菌。它感染對(duì)象多是嬰兒，特別是早產(chǎn)兒、低體重兒或免疫力低下新生兒。配方乳粉是主要的嬰幼兒的感染源。阪崎腸桿菌可以引起新生兒嚴(yán)重的菌血癥、壞死性小腸結(jié)腸炎和腦膜炎等疾病。雖然阪崎腸桿菌發(fā)病率不高，但死亡率可達(dá)50％-80％。雖然阪崎腸桿菌的大多數(shù)感染病例都與嬰兒有關(guān)，但近來的研究發(fā)現(xiàn)該菌還可以感染免疫力低下的成年人尤其是老人。2002年，國際食品微生物標(biāo)淮委員會(huì)對(duì)阪崎腸桿菌定為“對(duì)特定人群可以產(chǎn)生嚴(yán)重的生命危害及產(chǎn)生慢性實(shí)質(zhì)性或長期影響的后遺癥”的致病菌，被列為同單核細(xì)胞增生李斯特菌、肉毒梭菌的A型毒素及B型毒素、微小隱孢子蟲有同等的危害。
目前檢測阪崎腸桿菌的金標(biāo)準(zhǔn)是傳統(tǒng)分離鑒定法，該方法需經(jīng)過預(yù)增菌、選擇性增菌、分離培養(yǎng)、生理生化鑒定及血清型鑒定等步驟，整個(gè)過程繁瑣耗時(shí)(3-7天)；ELISA法、PCR方法以及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法對(duì)阪崎腸桿菌的檢測靈敏度高，然而它們需要較長的檢測時(shí)間、昂貴的儀器以及專業(yè)的技術(shù)人員。因此，建立快速、簡單、靈敏的檢測方法對(duì)食源性致病菌的檢測具有重要意義。
膠體金免疫層析試紙條以其操作簡單、快速(10-15min)、準(zhǔn)確等特點(diǎn)成為基層篩選的重要工具，然而由于膠體金的光學(xué)信號(hào)有限，膠體金免疫層析試紙條的靈敏度不高，對(duì)致病菌的檢測限通常不高于105CFU/mL，這個(gè)缺陷限制了其在食品和農(nóng)產(chǎn)品檢測中的應(yīng)用。因此，提高試紙條的靈敏度將為阪崎腸桿菌的檢測提供簡單、高效的途徑。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種快速、靈敏、簡便的阪崎腸桿菌定性、定量檢測技術(shù)。
本發(fā)明具體方案如下：
一種快速檢測阪崎腸桿菌的方法，包括以下步驟：
1)納米微球的制備：
a.添加0.4-0.8mmolFeCl3·6H2O和0.2-1.6mmol FeCl2·4H2O到100mL的去離子水中，向溶液中通入氮?dú)獠⒓訜岬?0-120℃，然后將3-7mL 25％的NH3·H2O添加到混合液中，反應(yīng)2h；用永磁鐵從反應(yīng)溶液中分離出黑色的固體物質(zhì)用高純水清洗3～5次，得Fe3O4納米粒子；
b.取12mg Fe3O4納米粒子用1-10mL去離子水和20mL乙醇的混合液重懸，先在緩慢攪拌的條件下加入0.3-0.9mL的NH4OH溶液，再將10-300uL正硅酸乙酯溶解在50uL乙醇溶液中逐滴加入，室溫下反應(yīng)12h，在Fe3O4納米粒子表面形成一層二氧化硅，用去離子水溶液清洗幾次，在乙醇溶液中復(fù)溶得到二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子；
c.把10-300uL的正硅酸乙酯，20mL無水乙醇，1-10mL去離子水和1mL 0.5-3mg/L的啡啰啉聯(lián)釕(Ru(bqy)32+)混合，將混合溶液加入0.5mL二氧化硅包覆的Fe3O4納米粒子，最后加入600-900μL的NH4OH，劇烈攪拌3h，得到Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球，用去離子水清洗備用；
d.將1mL的巰丙基三甲氧基硅烷添加到10mL的乙醇溶液中，用該混合物復(fù)溶Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球，在常溫下300rpm攪拌12h后，再80℃ 300rpm攪拌1h，離心得到硅烷化的Fe3O4/Ru(bqy)32+納米微球；
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