[發(fā)明專利]一種低氧促進小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201610031919.6
• 申請日: 2016-01-18
• 公開（公告）號: CN105624117A
• 公開（公告）日: 2016-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉慧雯;王艷艷;師淑君;趙丹;劉東華;王舒瑤;陳曦;許瑋蔚;汪思媛
• 申請（專利權(quán)）人: 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 北京君恒知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11466
• 代理人: 林潮;張璐

1.一種低氧促進小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： 構(gòu)建慢病毒載體，利用293T細(xì)胞包裝生產(chǎn)病毒，將攜帶轉(zhuǎn)錄因子Gata4、Mef2c和Tbx5的慢 病毒感染小鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞，將成纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞；重編程過程中轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞分別進行對照組常氧培養(yǎng)和低氧2％O₂+5％CO₂+93％N₂預(yù)處理6h、12h，在培養(yǎng)過程 中每天觀察重編程細(xì)胞的形態(tài)改變；在轉(zhuǎn)導(dǎo)后第1、2、3、4周，利用RT-PCR、免疫細(xì)胞化 學(xué)和流式細(xì)胞技術(shù)檢測低氧不同時間心肌特異標(biāo)記Myh6陽性的細(xì)胞比率；收集低氧組重編 程細(xì)胞，利用RT-PCR檢測HIF-1在重編程細(xì)胞中的表達(dá)，在mRNA水平上對其進行分析；

體外低氧條件2％O₂+5％CO₂+93％N₂下，培養(yǎng)小鼠背部皮膚成纖維細(xì)胞，實驗組分低氧 6h、12h、24h、48h組，常氧為對照組；用免疫細(xì)胞化學(xué)方法和RT-PCR檢測小鼠皮膚成纖 維細(xì)胞中HIF-1、Oct4和Uhrf1的表達(dá)，在蛋白和mRNA水平對其進行分析。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的低氧促進小鼠成纖維細(xì)胞重編程為心肌細(xì)胞的方法，其特征在 于，加入低氧條件后，RT-PCR檢測直接重編程第1、2、3、4周Myh6mRNA的表達(dá)，第4 周Myh6表達(dá)水平升高明顯，低氧6h組高于0h和12h；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測低氧條件下成 纖維細(xì)胞直接重編程為心肌細(xì)胞內(nèi)Myh6陽性率高于常氧組；低氧6h組Myh6的表達(dá)倍數(shù)是 對照組的4.59倍；流式細(xì)胞技術(shù)檢測到直接重編程后低氧6h組Myh6的表達(dá)量是對照組的 4.71倍P<0.05；低氧12h組與常氧組陽性細(xì)胞比率差異不大；RT-PCR結(jié)果顯示HIF-1在細(xì) 胞重編程的早期表達(dá)水平升高，低氧6h組高于低氧12h組，與Myh6的表達(dá)變化相同，證明 HIF-1在細(xì)胞直接重編程過程中被激活，起到促進細(xì)胞重編程的作用。