[發(fā)明專利]鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的方法及專用引物有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201610028876.6 | 申請日： | 2016-01-18 |
| 公開（公告）號： | CN105567825B | 公開（公告）日： | 2019-01-08 |
| 發(fā)明（設計）人： | 許賢;劉小民;王貴啟;李秉華;樊翠芹;祁志尊 | 申請（專利權(quán)）人： | 河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所 |
| 主分類號： | C12Q1/6895 | 分類號： | C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 石家莊元匯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13115 | 代理人： | 劉聞鐸 |
| 地址： | 050035 河北*** | 國省代碼： | 河北;13 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 鑒定 als 抑制劑 除草劑 播娘蒿 方法 專用 引物 | ||
本發(fā)明公開了一種鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的方法及專用引物，其中，專用引物包括6對，這些專用引物特異性強，可直接用于抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的鑒定；本發(fā)明的鑒定方法主要包括以下步驟：(1)對待測種群單株葉片提取基因組DNA；(2)以待測材料的基因組DNA為模板，分別用上述6對引物進行PCR擴增；(3)用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切；(4)對酶切產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測。本發(fā)明的有益之處在于：本發(fā)明提供的利用專用引物鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的方法，大大縮短了鑒定抗性播娘蒿材料的時間，只需2.5h就可得到準確的鑒定結(jié)果，提高了工作效率。
技術(shù)領域
本發(fā)明涉及鑒定抗性播娘蒿的方法及專用引物，具體涉及鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的方法及專用引物，其中，鑒定方法基于酶切擴增多態(tài)性序列(AleavedAmplified Polymorphic Sequences,CAPS)和衍生酶切擴增多態(tài)性序列(Derived CleavedAmplified Polymorphic Sequence,dCAPS)實現(xiàn)，能夠快速、準確鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的靶標基因的突變位點及突變氨基酸類型，屬于生物技術(shù)領域。
背景技術(shù)
播娘蒿是小麥田常見惡性雜草之一，在我國的東北、華北、西北、華東、四川等地區(qū)均有分布。該雜草發(fā)生嚴重的小麥田，會造成小麥大量減產(chǎn)，導致小麥減產(chǎn)最高可達39.36％。化學除草是防治播娘蒿的有效方法。
苯磺隆是防治播娘蒿的主要除草劑，其應用面積約占小麥田化學防治面積的70％。苯磺隆通過抑制雜草體內(nèi)ALS酶的活性，使支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸的生物合成受阻，導致雜草體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻，最后使雜草因營養(yǎng)缺乏而死亡。苯磺隆在我國小麥主產(chǎn)區(qū)的連年使用，導致了抗藥性雜草種群的出現(xiàn)。抗性播娘蒿種群的出現(xiàn)對有效防治播娘蒿提出了挑戰(zhàn)，快速確定抗性播娘蒿的發(fā)生情況，是制定有效防治措施的關(guān)鍵。
目前研究表明，播娘蒿體內(nèi)ALS酶的197位氨基酸、199位氨基酸、376位氨基酸和574位氨基酸發(fā)生突變是播娘蒿對苯磺隆產(chǎn)生抗性的分子機理。此外，播娘蒿有2個ALS基因，且在抗性播娘蒿植株中只檢測到其中一個ALS基因發(fā)生突變。采用基因同源克隆和直接PCR產(chǎn)物測序是檢測抗性播娘蒿突變位點的主要手段。
基因同源克隆需要將目的基因與載體連接，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞，活化、培養(yǎng)、檢測，再送測序公司測序，最后進行序列分析，確定基因的突變情況。這種方法費時、費錢、效率低。
采用PCR產(chǎn)物直接測序，雖然得到測序結(jié)果速度快，但是測序圖容易出現(xiàn)雜峰和套峰，實驗的準確性受到影響。
酶切擴增多態(tài)性序列(Aleaved Amplified Polymorphic Sequences,CAPS)是根據(jù)已知基因序列設計特異引物，需檢測的突變位點被包含在某種限制性內(nèi)切酶的酶切識別位點之內(nèi)，然后選擇合適限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進行酶切，根據(jù)酶切圖譜來檢測突變位點的一種技術(shù)。
衍生酶切擴增多態(tài)性序列(Derived Cleaved Amplified PolymorphicSequence,dCAPS)是通過在引物中導入錯配堿基使擴增序列產(chǎn)生酶切位點的變相的CAPS技術(shù)。
上述兩種技術(shù)具有操作簡便(用瓊脂糖凝膠電泳分析)、DNA用量少、結(jié)果準確、檢測效率高、成本低廉等優(yōu)點，已被廣泛應用于白菜、茶樹、西瓜等分子標記育種研究中。
但是，將上述兩種技術(shù)用在抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的檢測中尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供鑒定抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿專用引物，該專用引物特異性強，可直接用于抗ALS抑制劑類除草劑的播娘蒿的鑒定。
為了實現(xiàn)第一個目標，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
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