[發(fā)明專利]一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201610023769.4
• 申請(qǐng)日: 2016-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN105543172A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 盧連偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 盧連偉
• 主分類號(hào): C12N5/0784
• 分類號(hào): C12N5/0784
• 代理公司: 貴陽派騰陽光知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 52110
• 代理人: 管寶偉

1.一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)臍血的采集及預(yù)處理：

無菌條件下從正常分娩足月新生兒胎盤抽取臍帶血30～50ml,加入肝素抗 凝，以新生兒血清或成人的血清做為預(yù)處理的媒介，-15℃冷藏30分鐘；

(2)臍血的分離：

預(yù)處理后的臍帶血與Hank's液按體積比例為2:1混合，取一100ml離心 管，加入Ficoll-Paque分離液15～25ml，將臍帶血混合液30～50ml緩慢加于 分離液上，1800r/min,離心16～20min，離心結(jié)束后，離心管中液體分層，吸 取白色霧狀單個(gè)核細(xì)胞層到一新100ml離心管中；

(3)臍血CD34+細(xì)胞的純化：

用紅細(xì)胞裂解液除去紅細(xì)胞，再用PBS清洗單核細(xì)胞2～3次，計(jì)數(shù)，按 1×10⁷個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到含培養(yǎng)基Ⅰ的75cm²培養(yǎng)瓶中；使用磁性細(xì)胞分 選儀和CD34+細(xì)胞分選試劑盒分離和純化CD34+細(xì)胞；

(4)臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)：

臍血CD34+細(xì)胞重懸于培養(yǎng)基Ⅱ中，按1×10⁶/ml接種于6孔板中，每孔 2.5ml,在37℃、5％CO₂飽和濕度條件下培養(yǎng)4周，每周半量換液一次；

(5)測(cè)定CD34+擴(kuò)増的細(xì)胞的造血祖細(xì)胞集落(CFC)形成能力：

吸取足量的培養(yǎng)基Ⅲ到注射器中，并分裝到滅菌試管中,按1:10(v/v)的比 例將細(xì)胞添加到培養(yǎng)基Ⅲ中,扭緊試管蓋,振搖試管，以保證所有的成份充分混 勻,用IMDM+2％FBS稀釋至合適濃度,在6孔培養(yǎng)板中每孔接種2×10³個(gè)細(xì)胞， 37℃，5％C〇₂和飽和濕度條件下培養(yǎng)培養(yǎng)2周，在倒置顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。

2.如權(quán)利要求1所述的一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述培養(yǎng)基Ⅰ是由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加成分組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為 RPMI1640培養(yǎng)液，所述添加成分為：谷氨酰胺1～2.5ug/mL、β-巰基乙醇1％ (v/v)、碳酸氫鈉2～3.5ug/mL、胰島素1～5ug/mL、bFGF15～18ng/mL、維 生素C30～50ug/mL。

3.如權(quán)利要求1所述的一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述培養(yǎng)基Ⅱ配方如下：50～120ml胎牛血清、10～25ml非必需氨基 酸，1ml谷氨酰胺、2～8μlβ-巰基乙醇、1.0～1.5ml胰島素、1～4μlN-乙 酰-L-半胱氨酸、3～20μg細(xì)胞因子GM-CSF(購于美國PeproTech公司)、1～ 5μg肥大細(xì)胞生長因子(MGF)、0.2～1.0μg粒細(xì)胞-集落刺激因子(G- CSF)、0.3～2.0μg白細(xì)胞介素8、重組人白介素-11。

4.如權(quán)利要求1所述的一種體外擴(kuò)增臍血CD34+細(xì)胞的方法，其特征在 于，所述培養(yǎng)基Ⅲ是在MethoCult培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入重組細(xì)胞因子，所述重 組細(xì)胞因子包括：G-CSF50ng/ml、IL-1110ng/ml、IL-1β10ng/ml、 EPO6U/ml。