[發明專利]香菇L808菌種的EST-SSR標記引物及其應用

在審

• 申請號: 201610017286.3
• 申請日: 2016-01-12
• 公開（公告）號: CN105420401A
• 公開（公告）日: 2016-03-23
• 發明（設計）人: 宋婷婷;蔡為明;沈穎越;金群力;范麗軍;馮偉林;李良英
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 杭州賽科專利代理事務所(普通合伙) 33230
• 代理人: 張劍英

1.香菇L808菌種的EST-SSR標記引物，其特征在于，所述標記引物由名稱為Le808-1，Le808-2、Le808-3、Le808-4、Le808-5、Le808-6的6對SSR引物中至少一對構成；所述6對引物的正反核苷酸序列如下：

Le808-1:5′-ACCGGCATCTCTACCCTCAT-3′，5′-AGAGGATTCGGAGCAGGAGT-3′；

Le808-2：5′-AGAGGACAATAGCGCGAGTG-3′，5′-GAGCTGTCGATGATGGTCGT-3′；

Le808-3：5′-CAACCACGAGAAGGCGTAGT-3′，5′-GCATGGGTATGATTCGGGGT-3′；

Le808-4：5′-TCGGGAAAAGTACCTTGCGG-3′，5′-TTACTGTCTTCGCTTGCGGT-3′；

Le808-5：5′-TGCTCGGATCCTTCATTCCC-3′，5′-TTGATGACGCACCAGAGGAC-3′；

Le808-6：5′-GGTGCAACTAGGGTAGGTCG-3′，5′-TCGTACTGTCGAGGTGAGGT-3′。

2.如權利要求1所述的香菇L808菌種的EST-SSR標記引物在菌種檢測鑒定中的應用。

3.如權利要求2所述的應用的，其特征在于，步驟如下：

（1）菌絲固體培養：將香菇菌種轉接到覆蓋玻璃紙的馬鈴薯葡萄糖固體培養基中，20℃~25℃下培養，7-10d后收集菌絲；

（2）基因組DNA的提取：用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法提取上述菌絲的基因組DNA，紫外分光光度法和凝膠電泳兩種方法檢測總基因組DNA濃度和純度，盡可能調整樣品DNA的濃度一致；

（3）SSR分子標記的檢測：對上述提取的DNA進行基因SSR標記的PCR擴增；

PCR擴增體系為：總體積20μL，包括：10×PCRbuffer2μL，25mmol/LMgCl₂2μL，10mmol/LdNTP0.4μL，5U/μLTaqDNA酶0.2μL，10μmol/LSSR標記正/反向引物總體積1.5μL，濃度20-30ng/μLDNA模板2μL，ddH2O10.4μL；

PCR反應條件：94℃預變性5min；94℃變性30seconds，55-60℃退火30seconds，72℃延伸30seconds，共進行35個循環；最后進行72℃延伸5min；

（4）電泳檢測：將上述PCR擴增得到的產物與5μL加樣緩沖液混勻，點樣3.5μL于非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳，非變性聚丙烯酰胺凝膠的體積百分比濃度為10%，電泳緩沖液為1×TBE，電壓150v，電流200mA，功率200W，電泳45min，銀染，顯色，拍照，分析結果；

（5）菌種鑒定：采用6對EST-SSR引物對金針菇菌株進行PCR擴增，通過對照markerI可確定各SSR引物擴增的等位片段的數量和相對分子量，找到符合編號組合為：1(1+2+3)(1+2+3)(1+2+3+4)(1+2+3+4）(1+2)的菌種，即可確定該菌種為香菇菌種L808，如圖1中箭頭標注所示。