[發明專利]檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒

在審

• 申請號: 201610014199.2
• 申請日: 2016-01-11
• 公開（公告）號: CN105542001A
• 公開（公告）日: 2016-05-04
• 發明（設計）人: 王新平;邢澤黎;朱利塞;郭昌明;蓋小春;王明月;魯海冰;曹玉峰;劉亞靜;張群
• 申請（專利權）人: 吉林大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 長春市東師專利事務所 22202
• 代理人: 張鐵生

技術領域

本發明屬生物技術領域，具體涉及檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑 盒。

背景技術

牛腸道病毒（Bovineenterovirus，BEV）與人脊髓灰質炎病毒、人柯薩奇病毒、人 腸道致細胞病變孤兒病毒，豬腸道病毒等同屬小RNA病毒科腸道病毒屬中的成員，它所引起 的傳染病給養牛業造成嚴重的經濟損失。牛腸道病毒感染臨床上以發熱、流淚、咳嗽、流鼻 涕、呼吸困難和嚴重腹瀉為主要特征。本病自上世紀50年代首次由Moll等報道以來，其他國 家也相繼報道有本病發生。國內李英利等于2011年首次從內蒙某奶牛場的犢牛糞便樣品中 分離到一株F種腸道病毒，證實國內牛群中存在BEV感染。彭小薇等于2013年從北京地區某 發生嚴重腹瀉的奶牛也分離出一株F種牛腸道病毒。申請人于2012年從吉林長春地區爆發 的一種臨床上以呼吸困難和嚴重腹瀉，高發病率和高致死率為主要特征的不明疫病中首次 發現分離出E種腸道病毒HY12，確定了國內牛群存在E種腸道病毒感染。該病在國內為新發 傳染病，嚴重威脅養牛業的健康發展。有關BEV感染的診斷方法，尤其是具有特異、敏感、快 速與簡便、適于在基層牛場應用的檢測腸道病毒抗原的方法和試劑盒鮮有報道。

發明內容

本發明目的是提供一種檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒。

一種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，它是采用其堿基序列如序列表SEQIDNO.1所示 的VP1基因，表達VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆抗體。

一種E種腸道病毒酶標抗體，是采用其堿基序列如序列表SEQIDNO.3所示的VP2 基因，表達VP2蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體。

所述的一種E種腸道病毒酶標抗體標記了辣根過氧化物酶。

檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它的抗原捕獲抗體為上述的一 種E種腸道病毒抗原捕獲抗體，酶標抗體為上述的一種E種腸道病毒酶標抗體。

本發明提供了檢測E種腸道病毒病原的雙抗體夾心ELISA試劑盒，它采用其堿基序 列如序列表SEQIDNO.1所示的VP1基因，表達的VP1蛋白，免疫BALB/C小鼠后制備的多克隆 抗體為捕獲抗體，采用其堿基序列如序列表SEQIDNO.3所示的VP2基因，表達的VP2蛋白， 免疫BALB/C小鼠后制備的單克隆抗體，并標記了辣根過氧化物酶（HRP）。安全性、與RT-PCR 檢測結果具有100%符合率。試劑盒4℃保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異。

本發明的優點：

1、具有生物安全性。試劑盒所用的抗E種腸道病毒VP1和VP2的高免抗體為原核載體表 達的重組蛋白誘導BALB/C小鼠產生，不含E種腸道病毒，因此不存在散毒危險；

2、敏感性高。捕獲抗體和HRP標記二抗均具有很高的免疫效價，因此提高了試劑盒的敏 感性和特異性。試劑盒檢測E種腸道病毒陽性和陰性糞便樣品與RT-PCR檢測結果具有100% 符合率；

3、特異性強。試劑盒與其他病原體無交叉反應，只檢出E種腸道病毒抗原，具有很高特 異性；

4、穩定性好。試劑盒4℃保存6個月，檢測結果與常規方法無明顯差異，具有很好的穩定 性；

5、快速簡便。試劑盒2.0-2.5h即可報告結果，使用方便，一般技術人員按說明書即可 操作，條件一般實驗室均可進行；

6、不影響動物正常生產。待檢樣品為糞便，采集容易、方便、不影響動物正常生產，容易 被基層牛場接受；

7、價格便宜。約3元/頭份，HRP標記二抗和抗體制備技術成熟，均可大規模獲得。

附圖說明

圖1pGEX-4T-1-VP1和pGEX-4T-1-VP2重組質粒酶切鑒定（泳道2、3：pGEX-4T-1- VP1；泳道5、6：pGEX-4T-1-VP2；泳道1、7：pGEX-4T-1質粒陰性對照；泳道4：DNA分子marker）；

圖2重組蛋白的SDS-PAGE檢測結果（泳道3：pGEX-4T-1-VP1重組菌未誘導總蛋白；泳道 2：pGEX-4T-1-VP1重組菌誘導后總蛋白；泳道4：pGEX-4T-1-VP2重組菌未誘導總蛋白；泳道 5：pGEX-4T-1-VP2重組菌誘導后總蛋白；泳道1、6：蛋白分子marker）；