[發明專利]一種酶法再生ATP的方法

在審

• 申請號: 201610009080.6
• 申請日: 2016-01-06
• 公開（公告）號: CN105463043A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 劉珞;李成成;王崢
• 申請（專利權）人: 北京化工大學
• 主分類號: C12P19/32
• 分類號: C12P19/32;C12N9/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物化工領域，特別涉及一種酶法再生ATP的方法。

背景技術

ATP是生物體內最重要的高能磷酸化合物，在醫學上被廣泛用作肌肉萎縮、心肌梗塞、肝炎和各種急救病癥中的治療或重要輔助治療藥物。工業上也有許多重要的生物活性物質或生化藥物的生物合成過程，也都是需要ATP參加的酶促反應。所以，ATP的生產以及工業上ATP的循環再生成為酶工程發展的一個重要問題，是決定工業生產是否經濟節約的關鍵因素。

近年來，對ATP再生的研究主要在多聚磷酸激酶催化法，即以ADP和多聚磷酸為底物，由多聚磷酸激酶催化產生ATP。對于不同來源的多聚磷酸激酶，催化特點各不相同。如Thermotogamaritima來源的多聚磷酸激酶TePpk是一種嗜熱酶，它的最適溫度為70度，適合參與溫度較高的反應，但在多數常溫酶的最適溫度(30～37度)條件下酶活較低，不能與常溫酶的耦合反應，因此不能廣泛的滿足工業生產需求。還有一些多聚磷酸激酶，雖然最適溫度在30度左右，但是利用的多聚磷酸鹽聚合度較高，這種聚合度高的聚磷酸鹽在當前在市場上不易得到而且價格昂，這就提高了生產難度和生產成本。另一方面，就工業大量生產ATP而言，一些多聚磷酸激酶會受到多聚磷酸鹽的抑制，所以大規模生產時不得不采用流加多聚磷酸鹽的方法來減少抑制，使生產過程變得繁瑣。所以現在亟需找到一種合適的多聚磷酸激酶，使它既能與許多常溫酶耦合參與工業生產，又能夠使用比較常見且價格低廉的多聚磷酸鹽為磷酸供體，使ATP再生過程方便、廉價、高效。

與公知技術相比，本發明具有以下優點：

1)反應最適溫度為30～37度，符合工業生產上多數常溫酶的溫度要求，應用范圍廣泛。

2)磷酸供體為低聚合度的多聚磷酸鹽，相比聚合度為65或者更高聚合度的多聚磷酸鹽，這些低聚合度的多磷酸鹽價格低廉且常見易得，使ATP再生過程經濟、方便。

3)沒有聚磷酸鹽抑制現象，能在較高濃度的多聚磷酸底物作用下高效生產ATP。

發明內容

本發明的目的在于提供一種異源表達的聚磷酸激酶，以低聚合度的多聚磷酸鹽為磷酸供體，在聚磷酸激酶的催化條件下生成ATP，為多種消耗ATP的酶促反應源源不斷的提供能量。

本發明首先構建基因工程菌，異源表達來自谷氨酸棒狀桿菌的多聚磷酸激酶基因。即將基因ppk克隆至原核表達載體pET28a中得到多聚磷酸激酶基因表達載體pET28a-ppk。然后將表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，即可在胞內獲得多聚磷酸激酶。

蛋白表達后，通過超聲破碎將大腸桿菌中的多聚磷酸激酶釋放出來，獲得粗酶液。在三聚磷酸、四聚磷酸或者六偏磷酸或其鈉鹽為磷酸供體的條件下，以ADP為底物粗酶液催化產生ATP。

本發明提供的方法，以ADP為底物，利用價格低廉的三聚磷酸、四聚磷酸和六偏磷酸為磷酸供體，異源表達多聚磷酸激酶催化產生ATP，為經濟高效生產ATP并在此基礎上降低多種酶促反應的成本提供了一種創造性的方法。

圖1：DNA瓊脂糖凝膠電泳。左側為多聚磷酸激酶基因ppk的PCR產物，右側為DNA大小標準品。

圖2：pET28a-ppk質粒圖譜，將ppk基因克隆到pET28a載體上，基因的兩端有NcoⅠ和EcoRⅠ酶切位點。

圖3：誘導表達多聚磷酸激酶PPK蛋白電泳圖。泳道1為pET28a空質粒表達后破胞上清，泳道2為PPK酶表達后破胞上清。

圖4：谷氨酸棒狀桿菌來源的多聚磷酸激酶動力學參數曲線

圖5：嗜熱鏈球菌來源的谷胱甘肽合成雙功能酶以PPK催化生成的ATP為能源酶促產生谷胱甘肽的反應體系。30mM反應體系中分別添加5mM、10mM、15mM、20mM、30mMATP時，各時段的轉化率對比。“10hGS”為30mM反應體系中只加入了GS酶，僅靠外源添加的ATP提供能量，反應10h后取樣檢測得到的轉化率。“22hGS”為30mM反應體系中只加入了GS酶，僅靠外源添加的ATP提供能量，反應22h后取樣檢測得到的轉化率。“10hGS+PPK”為30mM反應體系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶重生的ATP提供能量，并在反應10h后取樣檢測的轉化率。“22hGS+PPK”為30mM反應體系中加入了GS酶和PPK酶，靠外源ATP和PPK酶再生的ATP提供能量，并在反應22h后取樣檢測的轉化率。

圖6：酶促反應生成3-磷酸甘油的實驗組和對照組的反應進程對比